RP- HPLC法測量藥物有關物質的不確定度評定

樂立源，葛朝霞

（邵陽市食品藥品檢驗所，湖南 邵陽 422001）

高效液相色譜法被廣泛應用于藥品的有關物質檢查中，由于本法不需要雜質對照品，當無法獲得雜質對照品時，本法成為最佳檢查計算有關雜質的含量的方法。不加校正因子的主成分自身對照法可以解決面積歸一化法中可能出現的儀器檢測范圍和線性范圍問題，而且操作簡單、運算方便，無需雜質對照品；缺點是本法會存在稀釋步驟、進樣針和進樣閥殘留、進樣誤差等影響因素，往往也會導致計算出的雜質與真實含量之間存在一定的誤差［3］。而一般有關物質檢查限度通常較低，大多數為1%左右。面對這樣一個限度值，什么樣的檢出數值才是可信值，誤差范圍有多大，什么樣的結果才能放心發出報告，本文試著從測量不準確度方向出發，分析有關物質結果誤差范圍的問題，償試找出誤差原因，為藥檢所日常檢驗提供依據。

1 測量原理及方法

有關物質檢查所用的方法多為藥典附錄VE第四法“不加校正因子的主成分自身對照法”。不加校正因子的主成分自身對照法本法是配制一個濃度與雜質限度相當的供試品溶液作為對照溶液，一般是由供試溶液直接稀釋得到，通常稀釋100倍（限度1%）。對照溶液有二個用途：一是用來調節儀器的靈敏度，二是用于與供試品溶液色譜圖上的雜質峰面積進行比較（相當于一個外標），以計算雜質的含量。

2 數學模型

其中X——藥品中所含有關雜質比例（百分比）；

A雜——藥品中檢出有關雜質峰峰面積（mAU＊sec）；

A標——標準溶液中主成分峰峰面積（mAU＊sec）；

F——對照溶液的稀釋倍數。

3 不確定度來源分析

由公式1得知，測量藥品中有關物質的量的不確定度主要來源于幾個方面：①重復性測量所得到的不確定度（Ur（R））；②對照溶液稀釋過程引入的不確定度（Ur（V））；③測量儀器帶來的不確定度（Ur（A））；④樣品均勻性引入的不確定度（Ur（U））。

4 不確定度各分量的評定

4.1 重復測量引入的不確定度評定

測量過程中的隨機因素對測量結果反映在一組重復性測量的條件下獲得的觀測列中，通過這樣一組觀測列可以計算由重復性引入的不確定度。本實驗按照藥典標準方法 對某一樣品進行10次重復檢測，測量結果見表1。

表1 藥品有關物質檢測結果

一般來說，有關物質檢查都是以兩次測量結果的平均值計算的，故重復檢測引入的不確定度為：

重復性測量引起的相對不確定度為：

4.2 稀釋倍數引入的不確定度

對照溶液的配制是在室溫（10℃～30℃）條件下配制的，溫度呈均勻分布，根據經驗可知，溫度引入的不確定度較小，可以忽略不計；此過程的不確定度主要由稀釋過程中使用容器或量器引入的，主要稀釋步驟如下：

對照溶液的配制：用1mL的移液管量取供試溶液1.00mL，用流動相定容至100mL容量瓶中，得到對照溶液。

由此可知，對照溶液稀釋過程中引入的不確定度分量主要有以下幾個方面：

UV1：對照溶液配制過程中使用1mL移液管引入的不確定度；

UV2：對照溶液配制過程中使用100mL容量瓶引入的不確定度；

在實驗中使用的均為A類玻璃器具，根據JJG-196-2006《常用玻璃儀器檢定規程》［4］規定：1mL移液管容量允許誤差為±0.007mL；100mL容量瓶容量允許誤差為±0.01mL。不確定度評定中，一般采用三角分布，K ＝，則標準溶液的配制過程中各種量器引入的相對不確定度為：

合成配制過程中量器引入的相對不確定度為：

4.3 測量儀器帶來的不確定度

根據JJG705-2002《液相色譜儀檢定規程》［5，6］高效液相色譜儀帶來的誤差最大不超過±3%。不確定度評定中，一般采用矩形分布，K ＝，則液相色譜儀引入的不確定度為

4.4 樣品不均勻性引入的不確定度

不均勻性體現了樣品特性量值存在分散性，可以通過一個修正因子來反映，數學期望值應為1，但其不確定度卻不為零，同批內藥品質量相對一致，而通過重復測量應已把不均勻性引入的不確定度包含在內，故不確定度不再計算。

5 計算合成不確定度

計算合成相對不確定度為：

計算合成標準不確定度：

6 擴展不確定度

取包含因子K＝2，計算擴展不確定度：

7 檢測結果與報告表示

檢得有關物質結果可以表示如下：

8 討論

從測量不確定度結果可以得出，檢測結果為1%，不確定度帶來的誤差可達到0.074%之多，約占結果的7.4%，換而言之，如果測量結果出現在（0.926%，1.074%）區間內，那么這個結果一定是可疑值，也就是藥檢系統常說的邊緣值，如果要發出這樣的報告書，所要遇到的報告書錯發風險將是最大的。將各不確定度分量繪圖（見圖1）。

圖1 不確定度分量

由圖1可以看到，稀釋過程引入的不確定度分量最小，儀器因素與重復測量所引入不確定度對總不確定度貢獻最大。試分析這兩個因素：儀器因素完全取決于儀器本身精度與日常維護，液相色譜儀每年的計量檢定與期間核查是儀器是否工作正常的最大保障。重復測量因素取決于兩點人員操作。人員操作因素關鍵在于實驗室規范操作與人員素質，相信這個相對于大多數藥檢所來說已經不是問題。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 ［M］.北京：中醫藥科技出版社，2005：149.

［2］JJF1059-2010測量不確定度評定與表示 ［S］.2010.

［3］余振喜，庚莉菊，黃海偉，等.淺談HPLC法測定有關物質時已知雜質的計算方法［J］.中國藥品標準，2010，11（4）：278-282.

［4］JJG-196-2006常用玻璃儀器檢定規程 ［S］.2006.

［5］JJG705-2002液相色譜儀檢定規程 ［S］.2002.

［6］鄭宗寅，吳惠英.液相色譜儀測量結果的不確定度評定 ［J］.科技創新導報，2010，12（4）：45.