高糖條件下forskolin誘導(dǎo)胰島系INS-1細(xì)胞血紅素氧合酶1的表達(dá)

楊怡 邵瑋娟 于志文

胰島素抵抗過程中的胰島細(xì)胞損害是糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制。氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)胰島素抵抗的主要因素之一。因此，對(duì)胰腺β細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究以及抗氧化治療成為糖尿病治療研究的內(nèi)容之一。

目前細(xì)胞中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2，Nrf2)受到格外關(guān)注。Nrf2即紅細(xì)胞系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2，調(diào)控的主要是多種抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶基因，包括血紅素加單氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase)等。上述酶均參與維持氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定。

研究提示典型的Nrf2下游調(diào)控酶，如HO-1的表達(dá)可改善細(xì)胞或組織的胰島素敏感性［1］。目前臨床上剛剛開始應(yīng)用的GLP-1藥物，通過激活PKA信號(hào)通路的途徑，已經(jīng)觀察到可以減輕胰島細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)［2］，PKA通路激活還可上調(diào)Nrf2功能［3］，但PKA激活劑 forskolin在胰島細(xì)胞能否調(diào)控HO-1表達(dá)以對(duì)抗胰島細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷至今尚未見報(bào)道。因此本文擬觀察forskolin對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)影響。實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果將對(duì)胰島素抵抗的抗氧化治療提供新的藥物作用機(jī)制解釋。

1 材料和方法

1.1 材料 INS-1細(xì)胞為大鼠胰島素瘤細(xì)胞系;RPMI-1640培養(yǎng)基;forskolin及葡萄糖;HO-1兔單抗、SOD2兔多抗、catalase兔多抗、羊抗兔二抗。

1.2 方法

1.2.1 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每周傳代1次。

1.2.2 胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的制備 INS-1細(xì)胞傳代培養(yǎng)2代后，將細(xì)胞按照5×106密度進(jìn)行傳代分組，即正常對(duì)照、高糖和forskolin3個(gè)組，分別持續(xù)培養(yǎng)4、19 h。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測(cè)HO-1蛋白的表達(dá) 取蛋白40 μg上樣，行10%SDS-PAGE電泳后，在轉(zhuǎn)移槽中將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，TBS緩沖液洗膜、封閉、4℃過夜。依次加入一抗(HO-1單抗1∶1000、SOD2多抗1∶500、catalase多抗1∶1000)二抗(羊抗兔 1∶4000、羊抗鼠1∶4000)，ECL發(fā)光法曝光顯影，結(jié)果經(jīng) Image-Pro plus6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 短時(shí)程作用 4 h 25 MM高糖培養(yǎng)細(xì)胞與10 MM葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照組相比，降低了HO-1和catalase的蛋白表達(dá);而forskolin在5 MM、10 MM葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞，均增加了上述兩種抗氧化酶的表達(dá)，并預(yù)防了高糖誘導(dǎo)的HO-1和catalase蛋白表達(dá)下降 (P＜0.05)，如圖1所示，forskolin孵育后HO-1和catalase的表達(dá)較未加forskolin組明顯上調(diào)。

2.2 長(zhǎng)時(shí)程作用 為了進(jìn)一步明確高糖和forskolin對(duì)胰島細(xì)胞抗氧化酶影響，將高糖和forskolin的孵育時(shí)間延長(zhǎng)到19 h，結(jié)果如圖2所示，19 h高糖孵育明顯降低SOD2的蛋白表達(dá)，而forskolin孵育后HO-1和SOD2、catalase的表達(dá)較單獨(dú)高糖處理組都有了明顯上調(diào)(P＜0.05)。

圖1 不同濃度葡萄作用4 h與Forskolin的協(xié)同作用對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶調(diào)節(jié)作用

圖2 不同濃度葡萄糖作用19 h協(xié)同F(xiàn)orskolin對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶調(diào)節(jié)作用

3 討論

Forskolin是一種腺苷酸環(huán)化酶(AC)激動(dòng)劑，激活A(yù)C催化亞基，使得細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高。cAMP作為第二信使激活PKA，從而使多種底物蛋白發(fā)生磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。PKA可進(jìn)一步調(diào)控CBP［CREB(Camp-response-elementbinding protein)-binding protein］從而影響Nrf2基因轉(zhuǎn)錄功能［3］。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)PKA可增強(qiáng)HO-1表達(dá)，這間接提示forskolin具有激活Nrf2作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明在持續(xù)高糖培養(yǎng)條件下，forskolin刺激的PKA信號(hào)通路可以消除高糖對(duì)Nrf2-ARE的抑制作用。但25 mM葡萄糖似乎對(duì)抗氧化酶的表達(dá)有一定的刺激作用。本文首次證實(shí)forskolin對(duì)多種抗氧化酶具有上調(diào)作用，且能保護(hù)高糖產(chǎn)生的抗氧化酶抑制作用。這項(xiàng)研究也對(duì)臨床上被應(yīng)用的GLP-1類藥物保護(hù)胰島細(xì)胞作用機(jī)制提供了新線索。

［1］ Hoehn KL，Salmon AB，Hohnen-Behrens C，et al.Insulin resistance is a cellular antioxidant defense mechanism.Proc Natl Acad Sci，2009，106:17787-17792.

［2］ Wideman RD，Yu IL，Webber TD，et al.Improving function and survival of pancreatic islets by endogenous production of ghcagonlike peptide 1(GLP-1).PNAS，2006，103(36):13468-13473.

［3］ Jianyong ZHANG，Tomonori HOSOYA，Atsushi MARUYAMA，et al.Nrf2 Neh5 domain is differentially utilized in the transactivation of cytoprotective genes.Biochem.J，2007，404，459-466.