乳腺癌耐藥蛋白BCRP表達與化療藥物敏感性的關系

張 瓊 譚小軍 鄭國沛

1.廣州醫學院附屬腫瘤醫院病理科，廣東廣州 510095；2.廣州醫學院腫瘤研究所，廣東廣州 510095

乳腺癌耐藥蛋白BCRP表達與化療藥物敏感性的關系

張 瓊1譚小軍1鄭國沛2

1.廣州醫學院附屬腫瘤醫院病理科，廣東廣州 510095；2.廣州醫學院腫瘤研究所，廣東廣州 510095

目的 探討乳腺癌組織中乳腺癌耐藥蛋白表達與臨床常用化療藥物敏感性之間的關系。 方法 選取42例乳腺癌組織標本，采用免疫組織化學S-P法檢測標本中BCRP表達，對同一標本應用膠滴腫瘤藥敏檢測技術進行體外藥物敏感性試驗。 結果 乳腺癌組織中BCRP陽性表達率為33.33%（14/42），BCRP陽性表達者中5-氟尿嘧啶、阿霉素耐藥組所占比例明顯高于BCRP陰性組（P＜0.05）。 結論 BCRP蛋白表達可以作為預測化療效果的一個重要參考指標，根據藥物敏感試驗結果進行藥物篩選，實現乳腺癌化療的個體化，對于提高患者生存質量，具有十分特殊的意義。

乳腺癌；乳腺癌耐藥蛋白；膠滴腫瘤藥敏檢測技術

近年來我國乳腺癌的發病率明顯增高，位居女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌易于轉移至外周淋巴結，其復發率和死亡率較高。雖然現代外科學手術方法取得了極大進展，但是對術后復發或轉移尚缺乏有效手段。化療是一種重要的輔助治療方法，但腫瘤細胞多藥耐藥常導致化療失敗。研究發現乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）與多種腫瘤的多藥耐藥密切相關[1]。本研究采用免疫組織化學S-P法檢測乳腺癌標本中BCRP表達，對同一標本應用膠滴腫瘤藥敏檢測技術（collagen gel droplet culture drug-sensitivity test，CD-DST）進行體外藥物敏感性試驗，為優化臨床乳腺癌治療方案提供有指導意義的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取筆者所在醫院2011年1～7月行乳腺癌根治術的42例乳腺癌患者作為研究對象。患者年齡23～78歲，平均（48.2±13.7）歲；病理類型：浸潤性導管癌35例，浸潤性小葉癌4例，其他類型3例；臨床分期：Ⅰ期5例、Ⅱ期23例、Ⅲ期11例、Ⅳ期3例。所有患者術前均未經化療、放療及免疫治療。

1.2 試劑和儀器

一抗為鼠抗人BCRP單克隆抗體，購自德國Merck公司，S-P試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。RPMI-1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司；鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自北京鴻躍科技有限公司；紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素、環磷酰胺均購自國內制藥廠。Image-Pro Plus圖像分析系統（media cybernetics，USA）。

1.3 病理學檢查

乳腺癌手術切除標本經中性福爾馬林固定后，在肉眼所見腫瘤實體無出血壞死處取材后進行脫水、包埋等常規組織學處理；石蠟包埋后進行連續切片，切片厚5 μm，一張HE染色后用于組織病理學的診斷，其余用于免疫組織化學分析。

1.4 方法

1.4.1 蛋白檢測 采用免疫組化S-P法，操作按試劑盒說明書進行。PBS代替一抗為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4.2 免疫組化結果判定標準 BCRP蛋白免疫反應以胞膜和胞質呈現棕黃色顆粒為陽性，結果判定采用Fromowitz[2]綜合計分法 ：（1）染色強度評分：無染色為0分，呈淡黃色顆粒、明顯高于背景為1分，呈淺棕黃色顆粒為2分，出現大量深棕黃色顆粒為3分；（2）陽性細胞數評分：所有切片隨機觀察5個高倍視野（×400），計數500個細胞中染色陽性細胞數，陽性細胞數＜5%為0分；陽性細胞數5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強度評分與陽性細胞數比例的評分相加之和＜2為陰性（-），2～ 3分為弱陽性（+），4～ 5分為中度陽性（++），6～ 7分為強陽性（+++）。

1.4.3 CD-DST試驗 無菌條件下將新鮮乳腺癌標本剪成0.5～1.0 mm組織碎塊，組織消化酶消化后篩網過濾，離心后去除上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基制成細胞懸液。冰浴條件下制備膠原蛋-細胞混合溶液，接種于24孔細胞培養板。培養24 h后，參照各抗癌藥物血漿高峰濃度加入培養液繼續培養24 h，同時設不加藥空白對照孔。甲基紫染色，甲醛固定后，倒置顯微鏡拍照，并利用圖像分析軟件自動計算腫瘤細胞數量。

1.4.4 CD-DST結果判定 藥物處理組細胞數/空白對照組細胞數的百分比表示藥物體外敏感性，如果該百分比≤50%判定為藥物在體外敏感。

1.5 統計學處理

應用SPSS15.0統計軟件對數據進行分析，計數資料采用x2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織中BCPR的表達情況

乳腺癌組織中BCRP陽性表達率為33.33%（14/42）， 其中強陽性3例，中等強度陽性8例，弱陽性3例。見圖1。

圖1 BCRP在乳腺癌組織中的表達（SP，×200）

2.2 膠滴腫瘤藥敏檢測結果

BCRP陽性表達者中5-氟尿嘧啶、阿霉素耐藥組所占比例明顯高于BCRP陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

迄今為止，乳腺癌的臨床治療仍然是以手術為主，輔以放療、化療和內分泌治療等。化療以能控制微小轉移，術前縮小原發灶，術后防止復發轉移以及失去手術機會的姑息治療等特點而在乳腺癌綜合治療中彰顯出不可替代的作用。但乳腺癌的多藥耐藥一直影響化療效果。多藥耐藥的形成機制復雜，涉及多個因素、多個環節及多條途徑，目前研究最深入的是ATP結合盒式（ATP binding cassette，ABC）超家族成員等膜轉運蛋白表達增高而介導的多藥耐藥。BCRP是ABC超家族中的新成員，與典型的轉運蛋白不同的是只含有一個結合結構域和一個疏水性的跨膜結構域，因此稱其為半轉運蛋白，主要通過水解ATP供能將細胞內的藥物泵出，降低細胞內藥物濃度從而導致耐藥[3]。本研究結果顯示，42例乳腺癌中BCRP蛋白陽性表達14例，陽性表達率為33.33%，與孫宇萍等[4]檢測60例臨床乳腺癌標本組織中BCRP陽性表達率為35%基本相近。

近年來研究證明BCRP在白血病[5]、肺癌[6]等許多惡性腫瘤的多藥耐藥中扮演著重要角色。越來越多的實驗資料顯示，BCRP通過形成同源二聚體或異源二聚體在乳腺癌細胞對米托蒽醌、托普替康、5-氟尿嘧啶等多種藥物的耐受中發揮著重要作用[7-8]。袁建輝等[9]利用四環素（tetracycline，Tet）調控BCRP體外表達的鼠成纖維細胞PA317細胞模型（PA317/Tet on/TRE-BCRP）研究發現，隨著細胞BCRP表達的增加，PA317/Tet on/TRE-BCRP細胞對5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、多柔比星、 吡柔比星、依托泊苷、米托蒽醌等藥物的耐藥指數增高，并且經5-氟尿嘧啶處理后細胞凋亡率隨之降低，證實了BCRP介導的5-氟尿嘧啶多藥耐藥機制除了將藥物“泵出”細胞外，還能增強細胞對凋亡的耐受。顏紅柱等[10]報道，浸潤性乳腺癌中BCRP的表達與ER呈負相關。Imai等[11]研究發現，ER陽性的乳腺癌細胞株中，雌激素能降低內源性BCRP的表達，但在ER陰性的細胞中卻無此作用。Wakabayashi等[12]也發現雌二醇可以下調ERα陽性的乳腺癌細胞中BCRP表達。但Ee PL等[13]報道，ER陽性的乳腺癌細胞株中雌激素可以誘導BCRP mRNA表達增強，與前述研究結果相矛盾。以上結果表明，乳腺癌BCRP表達水平可能受雌激素－雌激素受體信號通路的影響，但其具體機制復雜，有待于進一步探討。

本研究分析了乳腺癌組織中BCRP的表達與臨床常用乳腺癌化療藥物敏感性的關系，發現在BCRP陽性表達的14例患者中5-氟尿嘧啶和阿霉素耐藥組所占比例明顯高于BCRP陰性組，提示BCRP參與了乳腺癌對上述藥物多藥耐藥的形成。本研究結果表明，BCRP蛋白表達可以作為預測化療效果的一個重要參考指標，為在BCRP陽性的乳腺癌患者化療中避免使用這些耐受藥物起到十分重要的指導作用。根據藥物敏感試驗結果進行藥物篩選，實現乳腺癌化療的個體化，改觀化療效果，對于提高患者生存質量和生存率、避免不必要的化療藥物副作用，具有十分特殊的意義。

表1 乳腺癌組織中BCPR表達與化療藥物敏感性的關系[n（%）]

[1] Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al.A multidrug resistance transporter from human MCF 7 breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15665-15670.

[2] Friemon HF，Wolber RA，Berean KR，et al.Interobserver reproducibity of Nottingham modification of the Bloom and Richardson histologic grading Scheme for infihating ductM carcinoma[J].Am J Clin Patho，1995，103（2）：195-198.

[3] Litman T，Jensen U，Hansen A，et al.Use of peptide antibodies to probe for the mitoxantrone resistance-associated protein MXR/BCRP/ABCP/ABCG2[J].Biochim Biophys Acta，2002，1565（1）：6-16.

[4] 孫宇萍，王樹濱，陳亦欣，等.乳腺癌耐藥蛋白在乳腺癌組織中的表達及其與預后的關系[J].中國癌癥雜志，2004，14（2）：123-126.

[5] Jiang XJ，Wang J S，Fang Q.Gene Expression of breast cancer resistance protein in adult acute lymphocytic leukemia and its Clinical Significance[J].Journal of Experimental Hematology，2008，16（1）：31-34.

[6] Li XQ，Li J，Shi SB，et al.Expression of MRP1，BCRP，LRP and ERCC1 as prognostic factors in non-small cell lung cancer patients receiving postoperative cisplatin-based chemotherapy[J].Int J Biol Markers，2009，24（4）：230-237.

[7] Volk EL，Farley KM，Wu Y，et al.Overexpression of wild-type breast cancer resistance protein mediates methotrexate resistance[J].Cancer Res， 2002，62（17）：5035-5040.

[8] Houghton PJ，Germain GS，Harwood FC，et al.Imatinib mesylate is a potent inhibitor of the ABCG2（BCRP）transporter and reverses resistance to topotecan and SN-38 in vitro[J].Cancer Res，2004，64（7）：2333-2337.

[9] 袁建輝，賀智敏，呂輝，等.乳腺癌耐受蛋白介導的5-氟尿嘧啶耐受及機制[J].中國藥理學與毒理學雜志，2005，19（5）：357-362.

[10] 顏紅柱，余宏宇，劉會敏，等.浸潤性乳腺癌中耐藥基因蛋白MRP1和BCRP的表達及臨床病理意義[J].第二軍醫大學學報，2011，32 （2）：216-219.

[11] Imai Y，Ishikawa E，Asada S，et al.Estrogen-mediated post transcriptional down-regulation of breast cancer resistance protein/ABCG2[J].Cancer Res，2005，65（2）：596-604.

[12] Wakabayashi K，Tamura A，Ishikawa T.Genetic polymorphisms of human ABC transporter ABCG2：Porphyria risk and ER quality control[J].Seikagaku，2007，79（2）：151-157.

[13] Ee PL，Kamalakaran S，Tonetti D，et al.Identification of a novel estrogen response element in the breast cancer resistance protein（ABCG2）gene[J].Cancer Res，2004， 64（4）：1247-1251.

Correlation between the expression of breast cancer resistance protein BCRP and chemotherapy drugs sensitivity

ZHANG Qiong1TAN Xiaojun1ZHENG Guopei2
1.Department of Pathology,Guangzhou Medical University Cancer Hospital,Guangzhou 510095,China;2.Guangzhou Medical University Cancer Institute,Guangzhou 510095,China

ObjectiveTo explore the correlation between the expression of breast cancer resistance protein BCRP and the sensitivity to chemotherapeutic drugs commonly used in clinical.Methods42 cases of breast cancer tissue samples were selected. The expression of BCRP protein was detected in breast cancer tissues using S-P staining method. In vitro drug sensitivity tests were carried out on the same sample using collagen gel droplet culture drug-sensitivity test (CD-DST).ResultsThe positive expression rate of BCRP was 33.33%(14/42).Significantly higher 5-Fluorouracil and Adriamycinresistance rates were revealed in BCRP positive group than those in BCRP negative group (P＜0.05).ConclusionBCRP protein expression can be used as an important reference index for predicting the effect of chemotherapy. It is of special significance to implement individual breast cancer chemotherapy and improve the quality of life in patients with breast cancer according to the drug sensitivity test results.

Breast cancer;BCRP;CD-DST

R737.9

A

2095-0616（2012）11-12-03

廣東省廣州市醫藥衛生科技項目（201102A213008）。

2012-04-10）