炭疽雙組分疫苗的研究

魏 東 盧錦標 王國治

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

炭疽雙組分疫苗的研究

魏 東 盧錦標 王國治▲

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

目的 通過研究由重組炭疽保護性抗原與滅活炭疽芽孢桿菌菌體抗原組成的炭疽候選疫苗免疫小鼠，對其免疫效果進行評價。 方法 將小鼠隨機分成4個實驗組，在免疫后不同時間點采血進行抗體檢測、MTT法淋巴細胞增殖試驗、ELISPOT法IFN-γ細胞因子的測定以及保護力試驗。 結果 各組疫苗均能誘導較強的體液免疫應答。第3周rPA組及rPA＋炭疽菌體組經rPA抗原刺激后的刺激指數均高于對照組（P＜0.05）。ELISPOT結果顯示，各實驗組經特異性抗原刺激后均有較高的IFN-γ分泌。rPA抗原與炭疽菌體抗原有較好的保護力，由rPA與炭疽菌體組成的疫苗對炭疽活芽孢的攻擊保護率為100%。 結論 由rPA抗原與滅活炭疽菌體抗原組成的新型炭疽疫苗能誘導小鼠產生體液免疫應答和細胞免疫應答，具有較好的保護力，該疫苗有希望成為新一代炭疽疫苗。

炭疽疫苗；保護性抗原；體液免疫；細胞免疫

我國現用炭疽疫苗為減毒活疫苗[1]，成分為去除莢膜質粒pXO2的減毒活芽孢。該疫苗采用皮上劃痕方式接種，難以保證有效接種劑量。活疫苗具有一定殘余毒性，國外對該疫苗使用仍存在一定爭議。目前，美國使用的炭疽疫苗為AVA疫苗，由炭疽培養液經除菌過濾后加氫氧化鋁佐劑吸附制備而成，其主要成分是保護性抗原（protective antigen，PA）。該疫苗免疫程序周期過長，保護期短，需18個月內肌內注射5次，每年需加強免疫1次[2]。當前，對PA在新型炭疽疫苗設計中的主導作用已經達成共識，PA對疫苗的保護力起關鍵作用[3-5]。現有研究同時表明，活疫苗的保護效果好于以PA為主的炭疽疫苗，說明除PA外還有其他抗原成分對疫苗保護效果起重要作用[6]。

炭疽桿菌極有可能被用作生物戰劑和制造生物恐怖[7]，對社會穩定造成極大威脅，所以各國都在研制更為安全有效的新疫苗。炭疽芽孢桿菌在生命周期具有不同形態，從芽孢出芽增殖，到營養態菌體細胞，再到休眠體芽孢，可能存在不同的具有保護作用的抗原[8-11]。本研究以重組保護性抗原（recombinant protective antigen，rPA）為主要成分[12]，加滅活入炭疽菌體抗原，設計新型炭疽疫苗，并以小鼠作為模型，對炭疽疫苗的免疫學作用進行初步研究，為新型炭疽疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

Al（OH）3佐劑由蘭州生物制品研究所有限責任公司菌苗二室提供，rPA抗原、滅活炭疽菌體抗原由中國食品藥品檢定研究院細菌一室提供。MTT（美國Sigma公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG（北京中杉生物技術有限公司）；ELISPOT小鼠IFN-γ檢測試劑盒（瑞典Mabtech公司）豚鼠由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供。MK3酶標儀（芬蘭Labsystems Dragon公司）ELISPOT自動讀板儀（美國CTL公司）。

1.2 分組及免疫

將80只6～8周齡的Balb/c小鼠，隨機分為4組，每組20只。（1）Al（OH）3佐劑對照組；（2）rPA組（10 μg/0.2 mL/只）；（3）炭疽菌體組（1億菌 /0.2 mL/只）；（4）rPA ＋炭疽菌體組（劑量同前）。分別在第0、2周免疫，注射部位均為后肢肌內。分別于第3、4周每組取5只動物進行檢測。用淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞進行ELISPOT和MTT等細胞免疫應答的檢測，將分離的血清做ELISA體液免疫應答的檢測。

1.3 抗體檢測

包被抗原，rPA包被濃度為5 μg/mL，炭疽菌體濃度均為1億/mL，4℃過夜。封閉液封閉1 h后，每孔加入100 μL的50倍開始倍比稀釋的待檢血清，按ELISA操作步驟分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體，底物顯色，終止反應，并在波長450 nm處檢測吸光值A450。

1.4 淋巴細胞增殖試驗（MTT法）

分離的外周血單個核細胞加入96孔細胞培養板，每孔加入100 μL 2.5×106/mL濃度的細胞，用完全培養液稀釋rPA抗原為20 μg/mL，炭疽菌體抗原濃度均為0.1 億/mL。試驗孔各加100 μL，均做復孔，同時用完全培養液作陰性對照，ConA作陽性對照。在37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱中培養3 d，每孔加入 15 μL MTT（5 mg/mL），于 37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱中繼續培養4 h，離心棄上清液，加入100 μL細胞裂解液后用酶標儀測定吸光值A570/630，測定波長570 nm，參考波長630 nm。計算復孔的A570/630平均值，計算刺激指數（SI），（SI=實驗孔A570/630/陰性對照孔A570/630）。

1.5 脾淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ的測定

取96孔IFN-γ檢測細胞培養板，細胞及抗原操作同1.4。于37℃，5%CO2的二氧化碳培養箱中孵育48 h后，按ELISPOT操作依次加入檢查抗體等試劑，洗板，顯色，計數斑點數。

1.6 保護力試驗

第2次免疫后2周，每組取10只小鼠，腹腔注射弱毒株炭疽芽孢6億/只。每天觀察小鼠狀態，連續觀察14 d。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 抗體效價結果

2.1.1 抗rPA抗體結果 rPA組和rPA+炭疽菌體組均能誘導產生PA抗體，各組第4周的rPA抗體效價較第3周均有小幅增加。第3周rPA組小鼠血清中的rPA抗體高于rPA+炭疽菌體組（P＜0.05）。第4周兩組rPA抗體效價比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 抗rPA抗原IgG抗體效價

2.1.2 抗炭疽菌體抗體結果 炭疽菌體組和rPA+炭疽菌體組都可產生高效價的抗炭疽菌體抗體，且第4周較第3周抗體效價均有升高趨勢，各組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 抗炭疽菌體抗原IgG抗體效價

2.2 脾淋巴細胞增殖結果

第3周rPA組及rPA+炭疽菌體組經rPA抗原刺激后的刺激指數均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。炭疽菌體組及rPA+炭疽菌體組經炭疽菌體抗原刺激后的刺激指數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。第4周各組間比較差別無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 第3周脾臟淋巴細胞增殖結果

2.3 ELISPOT測定IFN-γ結果

2.3.1 第3周ELISPOT結果 rPA組及rPA+炭疽菌體組經rPA抗原刺激后產生的斑點數均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。炭疽菌體抗原的刺激作用較為強烈，由于孔中斑點數太多，儀器無法計數，見表1。

表1 第3周抗原刺激后IFN-γ斑點計數結果（2.5×105 cell）

2.3.2 第4周ELISPOT結果 除了rPA組，其他實驗組經各種抗原刺激后產生的斑點數均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01），結果見表2。

表2 第4周抗原刺激后IFN-r斑點計數結果（2.5×105 cell）

2.4 保護力試驗結果

每只小鼠在6億炭疽活芽孢的攻擊下，除對照組外其余各組保護率均為100%，結果見表3。這表明，除rPA外，炭疽菌體抗原對小鼠的免疫保護也起著重要作用。

表3 小鼠攻毒試驗結果（存活數/總數）

3 討論

以PA為主要成分疫苗保護力來自其誘導產生的抗體對炭疽毒素的中和作用，但其對炭疽芽孢桿菌在體內的繁殖及毒素分泌沒有直接抑制作用，而且炭疽毒素是由炭疽菌體分泌產生。如果疫苗中加能入抑制炭疽菌體繁殖的成分，有可能提高疫苗的保護效果[13-14]。本研究以PA為主要成分輔以滅活炭疽菌體抗原，設計新型炭疽疫苗，以小鼠作為模型，對新型炭疽疫苗的免疫學作用進行初步研究。

在細胞免疫檢測方面采用了淋巴細胞轉化試驗和ELISPOT試驗。淋巴細胞轉化試驗是通過檢測特異性抗原刺激后細胞增殖來評價疫苗的細胞免疫應答。rPA抗原體外能刺激脾淋巴細胞增殖，第3周的試驗中，rPA組和rPA+炭疽菌體組經rPA抗原刺激后的刺激指數均高于對照組。ELISPOT試驗是通過檢測特異性抗原刺激后分泌細胞因子的淋巴細胞數量來評價疫苗的細胞免疫應答。免疫后經不同刺激物刺激后產生的斑點數均高于對照組，說明新型疫苗能誘導較強的細胞免疫應答。通過ELISA方法測定抗體效價來評價體液免疫應答。對于主要在細胞外生長的細菌，有效的體液免疫應答能起到重要的保護作用。rPA組和rPA+炭疽菌體組均能誘導產生PA抗體。炭疽菌體可以誘導較強的體液免疫應答，炭疽菌體組和rPA+炭疽菌體組都可產生較高效價的抗炭疽菌體抗體。

保護力試驗中每只小鼠腹腔注射6億炭疽活芽孢進行攻擊，除對照組外其余各組保護率均為100%。單純的炭疽菌體能提供很好的保護作用，提示在以PA為主要成分的基礎上，輔以滅活炭疽菌體成分，有可能提供更全面的保護。由于實驗條件所限，攻毒菌株采用炭疽弱毒菌株，有待使用強毒株進行攻擊試驗來進一步驗證新型炭疽疫苗的保護效果。但從目前的實驗結果看來，rPA與滅活炭疽菌體抗原除成的雙組分疫苗是一種有希望的炭疽疫苗。

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Research of the immunological response of anthrax candidate vaccine

WEI Dong LU Jinbiao WANG Guozhi
National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

ObjectiveTo evaluate the immune response of a new anthrax candidate vaccine,which is composed of recombinant PA antigen and somatic antigen of vegetative Bacillus anthracis.MethodsMice were randomly divided into four experimental groups, and they were tested at different times for serum ELISA,MTT cell proliferation, ELISPOT and efficacy test.ResultsELISA results showed that all groups can induce humoral immunoresponse. Lymphocyte proliferation was detected on the 3rd week in groups containing rPA. ELISPOT result showed that the number of spleen lymphocytes which secreted IFN-γ after stimulated with specific antigen was higher in experimental groups than control group. Mice immunized with rPA and somatic antigen were fully protected against an intraperitoneal challenge with live Bacillus anthracis spores.ConclusionThe new anthrax candidate vaccine composed of rPA and somatic antigen can induce significant humoral and cellular immune response, which would be a new generation of anthrax vaccine.

Anthrax vaccine; Protective antigen; Humoral immunity; Cellular immunity

R392

A

2095-0616（2012）11-24-03

國家科技重大專項課題（2009ZX10004-804）。▲

2012-04-18）