注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查的方法學驗證

李夏林 覃 曉

廣西壯族自治區桂林食品藥品檢驗所，廣西桂林 541002

注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查的方法學驗證

李夏林 覃 曉

廣西壯族自治區桂林食品藥品檢驗所，廣西桂林 541002

目的建立注射用頭孢呋辛鈉的無菌檢查方法。方法按《中國藥典》2010版二部附錄Ⅺ H“無菌檢查法”項下的要求，采用薄膜過濾法，接種至含有頭孢菌素酶的培養基中進行試驗。結果方法驗證試驗的供試品試驗管和陽性對照管中的試驗菌均生長良好。結論本法能滿足注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查的方法學要求。[關鍵詞]方法學驗證；注射用頭孢呋辛鈉；無菌檢查

頭孢呋辛鈉屬β-內酰胺類抗生素中的頭孢菌素類，對革蘭陽性球菌和部分革蘭陰性桿菌均敏感。可用于敏感菌所致的呼吸道感染、耳、鼻、喉科感染、泌尿道感染、皮膚和軟組織感染、骨和關節感染、產科和婦科感染、淋病等[1]。根據《中國藥典》的要求，當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產品的無菌檢查[2]。現將注射用頭孢呋辛鈉的無菌檢查方法建立報道如下。

1 儀器與材料

HTY-2000A集菌儀、KDGB220和KDGB330集菌培養器，杭州高得醫療器械有限公司生產。驗證試驗用菌種包括金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63501]、生孢梭菌 [CMCC（B）64941]、白色念珠菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉菌 [CMCC（F）98003]，均來自中國醫學細菌保藏中心，均為第3代。硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基、改良馬丁瓊脂培養基、營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均為北京三藥科技開發公司生產。頭孢菌素酶凍干粉（500萬U/支）杭州北望生物技術有限公司生產。注射用頭孢呋辛為國內藥廠生產，規格為0.75 g。

2 實驗方法

2.1 菌液制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，分別于30～35℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，于23～28℃培養24～48 h。分別取上述培養物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋成50～100 cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，于23～28℃培養5～7 d，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL洗脫孢子，將孢子液移至比濁管中，于細菌標準比濁管進行比較，取1 mL孢子原液用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成含孢子數50～100 cfu/mL的孢子懸液。各菌液計數結果見表1。

2.2 方法驗證

取供試品6瓶用0.9%無菌氯化鈉溶液90 mL溶解，混勻，于集菌儀上通過一副KDGB220集菌培養器中的一聯濾筒中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 mL，共5次，在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu的試驗菌，過濾，然后泵入100 mL培養基，并加入約500萬U的頭孢菌素酶。在另一濾筒中泵入100 mL培養基，并加入等量的試驗菌，作為陽性對照。每種試驗菌及相應的培養基同法逐一處理。另取一副KDGB220集菌培養器，分別泵入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基至兩個濾筒中，作為陰性對照。上述集菌培養器分別置規定溫度培養3～5 d。見表2。

表2 注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查驗證實驗結果

2.3 供試品測定

取供試品9瓶，用0.9%無菌氯化鈉溶液140 mL溶解，混勻，于集菌儀上通過一副KDGB330集菌培養器中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次300 mL，共5次，在其中兩管泵入各100 mL硫乙醇酸鹽流體培養基（其中一管接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌作為陽性對照），另一管泵入100 mL的改良馬丁培養基，并在每管中加入約500萬U的頭孢菌素酶。另取一副KDGB220集菌培養器，取上述溶劑和沖洗液同法操作，分并別泵入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基，作為陰性對照。將集菌培養器分別按規定溫度培養14 d，逐日觀察并記錄，結果供試品管和陰性對照管均澄清，陽性對照管在48 h內菌生長良好，本實驗結果成立。

表1 細菌和真菌計數結果（菌數為2個平皿的平均數，cfu/mL）

3 討論

頭孢呋辛鈉為頭孢菌素類廣譜抗生素，對敏感菌有較強的抗菌活性，故在該品種的無菌檢查時，應采取適當的方法消除和破壞其抗菌活性。作者在摸索該品種薄膜過濾法實驗條件時，在相同樣品量的情況下，曾采取僅用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗的方式，供試品試驗管在規定時間內有試驗菌生長微弱、緩慢或不生長的情況。而采取用含適量頭孢菌素酶的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗的方式，也存在某些供試品試驗管的試驗菌在規定時間內生長微弱、緩慢的情況，說明這兩種方法均不能有效消除頭孢呋辛鈉的抗菌活性。只有采取本文中將適量頭孢菌素酶加入培養基的方法，使酶與藥品能充分地接觸，酶解作用完全，得以有效地滅活濾器中殘留頭孢呋辛鈉的抗菌活性，而且所需沖洗液的量和沖洗次數也較合適，從而確認頭孢呋辛鈉在本文試驗條件下方法的可靠性，可以保證檢驗結果的準確可靠。

[1]國家藥典委員會.臨床用藥須知：化學藥和生物制品卷（2010年版）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2011：650.

[2]國家藥典委員會.中國藥典（二部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄104.

R917

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2095-0616（2012）11-88-02

2012-04-26）