HPLC法測定鹽酸吉西他濱的有關物質

趙軍軍 李孝壁 馬平平 孔雙華 楊寶海 王春玲

江蘇豪森醫藥研究院有限公司，江蘇連云港 222000

HPLC法測定鹽酸吉西他濱的有關物質

趙軍軍 李孝壁 馬平平 孔雙華 楊寶海 王春玲

江蘇豪森醫藥研究院有限公司，江蘇連云港 222000

目的改進鹽酸吉西他濱有關物質的測定方法。方法采用迪馬 C8（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，梯度洗脫檢查，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長275 nm。結果在0.005～2.402μg/mL范圍線性關系良好，相關系數r＞0.999（n=5）,重復性試驗的RSD＜0.000 5%（n=6）。結論本方法簡單、準確、重現性好，可用于鹽酸吉西他濱的有關物質檢查。

鹽酸吉西他濱；有關物質；HPLC

鹽酸吉西他濱（gemcitabine hydrochloride）化學名2-脫氧-2，2-鹽酸二氟脫氧胞苷（β-異構體），是一種阿糖胞苷類似物，屬于新型抗嘧啶核苷酸代謝化療藥物，屬細胞周期特異性抗代謝類藥物，主要作用于DNA合成期的腫瘤細胞，即S期細胞。在一定條件下，可以阻止G1期向S期的進展；具有抗瘤譜廣、作用機制獨特、毒性反應低、與其他化療藥物無交叉耐藥且毒性反應無疊加等特點。在過去的臨床工作中，筆者觀察到鹽酸吉西他濱是療效較好而毒副反應較少的化療藥物之一[1-2]。有關物質直接反映藥品的安全性，本研究采用高效液相色譜法[3-4]對有關物質[5-6]的檢查進行了詳細的研究。

1 儀器與試劑

儀器：電子分析天平，梅特勒XS105；Agilent 1200系列（G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B VWD，G1315D DAD）；Agilent化學工作站；色譜柱：辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（迪馬C8250 mm×4.6 mm，5μm）。

試劑：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸均為分析純是國藥集團化學試劑股份有限公司生產；純化水由本公司生產；甲醇為色譜純，德國MERCK公司生產。

2 試驗過程與結果

2.1 色譜條件（表1）

照高效液相色譜法，用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（迪馬C8250 mm×4.6 mm，5μm）；以磷酸二氫鈉溶液（稱取15.6 g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶解在900 mL水里，加2.5 mL磷酸，加水稀釋至1 000 mL，搖勻）作為流動相A，甲醇為流動相B；進行梯度洗脫；檢測波長為275 nm；流速為每分鐘1 mL。

表1 色譜條件

2.2 系統專屬性試驗

配制含有α-異構體的系統適用性溶液，作為溶液A，量取20 μL進樣，RRT=0.7處能檢測到α-異構體；稱取鹽酸吉西他濱（含有3’-鹽酸吉西他濱差向異構體）配制成濃度為2 mg/mL的溶液，作為溶液B，量取20μL進樣，在RRT=0.9處能檢測到3’-鹽酸吉西他濱差向異構體；稱取胞嘧啶標準品配制成0.05 mg/mL的溶液，作為溶液C，量取20μL進樣；精密稱取鹽酸吉西他濱標準品配制成1 mg/mL的溶液，置于90℃水浴中加熱4 h，靜置，冷卻至室溫，作為溶液D，量取20μL進樣，在RRT=1.9處能檢測到熱降解雜質；精密稱取鹽酸吉西他濱標準品配制成1 mg/mL的溶液，移取2 mL至20 mL量瓶中，加入9 mL 30%雙氧水，靜置3 d，作為溶液E，量取20μL進樣，在RRT=0.8處能檢測到氧化雜質；溶液A 2 mL+溶液B 2 mL+溶液C 0.5 mL+溶液D 2 mL+溶液E 2 mL混合作為溶液F，精密量取溶液F 20μL進樣，考察各雜質與吉西他濱的的分離情況。各雜質的分離情況見表2。專屬性圖見圖1。

表2 方法專屬性試驗結果

圖1 方法專屬性色譜圖

2.3 定量限與檢測限

分別配制每毫升中約含鹽酸吉西他濱2 mg、胞嘧啶0.2 mg、α-異構體1 mg的溶液，逐步稀釋，進樣，至信噪比（S/N）為3左右為檢測限，至信噪比為10左右為定量限； 配制每毫升中約含鹽酸吉西他濱（含有3’-鹽酸吉西他濱差向異構體）2 mg的溶液，進樣至3’-鹽酸吉西他濱差向異構體信噪比為3左右為檢測限，至信噪比為10左右為定量限。見表3。

表3 檢測限與定量限

2.4 線性關系試驗

按照標準限度濃度配制線性試驗溶液，胞嘧啶在0.005～2.402μg/mL，α- 異構體在 0.011～2.156μg/mL，3’-差向異構體在0.023～2.774μg/mL，測定結果線性相關系數皆不小于0.999，說明本方法線性良好。見表4。

2.5 重復性

精密稱取鹽酸吉西他濱樣品50 mg，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀釋到刻度，搖勻；平行6份，按照所確定的方法進行測定。見表5。

表4 線性關系

2.6 溶液穩定性

取鹽酸吉西他濱適量,用水溶解并稀釋制成每毫升約含2 mg的溶液。考察溶液在24 h的穩定性。見表6。

2.7 方法耐用性

按下表所列將緩沖溶液的pH值，緩沖溶液與甲醇比例，柱溫，柱批次進行微小的變化，精密量取鹽酸吉西他濱系統適用性溶液20μL進樣，察看主峰的保留時間RT，計算理論塔板數N，拖尾因子T，鹽酸吉西他濱和α-異構體的分離度R察看方法的耐用性。見表7。

表5 重復性試驗結果

表6 溶液穩定性試驗結果

表7 方法耐用性

3 討論

本研究建立了有關物質的測定方法，并通過對雜質的專屬性、檢測限、定量限、線性范圍、重復性、溶液穩定性、方法耐用性等項目的考察，充分說明本研究確定的方法能有效準確地測定鹽酸吉西他濱中可能存在的有關物質。

[1]李留樹，王如良.非小細胞肺癌的治療進展[J].解放軍保健醫學雜志，2011，3：199-200.

[2]陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學[M].北京：人民衛生出版社，2004：675-676.

[3]劉文英.藥物分析[M].北京：人民衛生出版社，2006：81-84.

[4]張數秀，曹志勝，惠秋莎.最新藥品注冊工作指南[M].北京：中國醫藥科技出版社，2007：64-70.

[5]國家藥典委員會.中國藥典二部附錄[M].北京：化學工業出版社，2010：54.

[6]國家食品藥品監督管理局.化學藥物雜質研究技術指導原則//藥品研究技術指導原則[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：155.

Determination of gemcitabine hydrochloride and its related substances by HPLC

ZHAO Junjun LI Xiaobi MA Pingping KONG Shuanghua YANG Baohai WANG Chunling

Jiangsu Hansoh Medicine Research Institute Co.,Ltd,Lianyungang 222000,China

ObjectiveTo improve the determination of related substances in gemcitabine hydrochloride.MethodsThe determination was carried out on a Dikma C8(250 mm×4.6 mm,5μm)column with gradient elution.The detection wavelength of UV detector was 275 nm.ResultsThere was a good linearity over the range of 0.005-2.402μg/mL with a the correlation coefficient higher than 0.999(n=5).The RSD for repeatition was less than 0.0005%(n=6).ConclusionThe method was simple,accurate and good reproducibility,which can be used for the determination of related substances for gemcitabine hydrochloride.

Gemcitabine hydrochloride;Related substances;HPLC

R-33

B

2095-0616（2012）18-106-03

2012-06-05）