鄰苯二甲酸單芐酯單克隆抗體的制備

李 樂，任洪林，李巖松，周 玉，馮曉麗，劉艷艷，唐 峰，李兆輝，王光明，盧士英，柳增善

（吉林大學(xué) 人 獸共患病研究所教育部重點實驗室 畜 牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長 春130062）

鄰苯二甲酸酯類（PAEs）屬于環(huán)境激素類物質(zhì)，以增塑劑、軟化劑、載體等應(yīng)用在化妝品、洗滌用品、建筑材料和潤滑油中［1］。人體可通過呼吸，飲食，皮膚接觸等方式攝入PAEs，進入人體內(nèi)被代謝成相應(yīng)的單酯，且有毒性單酯的及生物活性超過雙酯［2］。尿液中鄰苯二甲酸單芐酯（mono－benzyl phthalate，MBzP）與精子的活力和精子的濃度有關(guān)，可影響生殖系統(tǒng)的相關(guān)激素的水平，對胎兒及男性生殖系統(tǒng)有一定的影響［3，4］。研究發(fā)現(xiàn) MBzP對SD大鼠具有胚胎毒性，可引起胚胎生長緩慢，同時對胚胎有致畸作用。目前，對MBzP的檢測方法主要是反相高效液相色譜分析法（HPLC），此方法費高，時長，無法用于現(xiàn)場檢測。而免疫法有速度快、費用低、儀器易攜、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)點。本研究通過制備鄰苯二甲酸單芐酯的單克隆抗體為免疫學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Balb／c小鼠，雌性，8－10周齡，購于長春生物制品研究所；SP2／0－Ag14小鼠骨髓瘤細胞，為本實驗室保種傳代。

1.2 主要試劑 MBzP購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、鄰苯二胺（OPD）、HAT、HT、50%PEG1000等購自美國Sigma公司；四季清胎牛血清為長春寶泰克生物制品有限公司產(chǎn)品；PRMI－1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；辣根過氧化物標記羊抗鼠IgG購自中杉金橋。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡（Olympus）；CO2培養(yǎng)箱（上海力新公司）；96孔可拆卸酶標板、酶聯(lián)免疫檢測儀（NUNC公司）。

1.4 方法

1.4.1 MBzP完全抗原的制備 利用 MBzP分子中的羧基在N，N－二環(huán)己基碳二亞胺的作用下與N－羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)生成活潑酯衍生物，后者與載體蛋白的氨基反應(yīng)，形成以酰胺鍵連接的偶聯(lián)物，具體制備方法參照文獻［5，6］。完全抗原用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定。

1.4.2 小鼠的免疫 MBzP－BSA與等量的弗氏完全佐劑混合乳化，皮下多點注射免疫，100μl／只，免疫三只；每隔15 d免疫一次，三免后第7 d，小鼠斷尾采血，用ELISA法檢測血清效價，具體步驟參見文獻［7］。

1.4.3 單抗的制備 血清效價達到細胞融合要求后，進行細胞融合。采用有限稀釋法將陽性雜交瘤細胞克隆化，直到克隆細胞陽性率達到100%時再進行擴大培養(yǎng)。采用體內(nèi)誘生法制備腹水，利用辛酸－硫酸銨方法純化腹水［8］。然后對純化的腹水進行SDS－PAGE鑒定，檢測純化后腹水的抗體純度。1.4.4 單抗的亞類及親和力的鑒定 利用小鼠單抗亞類鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的亞類類型。按照試劑盒說明書操作。利用間接ELISA方法對抗體的親和力進行測定［9］。

2 結(jié)果

2.1 MBzP完全抗原的鑒定

偶聯(lián)產(chǎn)物因連接上小分子使其電荷數(shù)量改變，遷移速率變快，證明完全抗原制備成功。鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 MBzP完全抗原的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

2.2 單抗的篩選與鑒定 小鼠第三次免疫7 d后，檢測小鼠血清效價，按P／N≥2.1為陽性，效價可達到1∶25600，符合細胞融合的要求。選擇血清效價最高的小鼠進行細胞融合。利用間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細胞1B9，經(jīng)過三次克隆后陽性率達到100%，進行擴大培養(yǎng)注入小鼠體內(nèi)，制備腹水。利用辛酸－硫酸銨法純化腹水，純化后的腹水進行SDS－PAGE電泳，可見清晰兩條帶，一條為重鏈，另一條為輕鏈，雜帶明顯減少，得到了相對較純的單克隆抗體。結(jié)果如圖2所示。采用間接ELISA法檢測純化后的腹水，結(jié)果顯示單克隆抗體1B9的腹水效價可達1：1.28×105。經(jīng)過亞類試劑盒鑒定此株單抗亞類為Ig M。抗體的親和常數(shù)為2.32×108。

圖2 腹水純化SDS－PAGE圖

3 討論

MBzP是小分子物質(zhì)，屬于半抗原，只有反應(yīng)原性，不具有免疫原性，不能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，需要與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才能達到免疫效果。半抗原與載體蛋白連接時，需要根據(jù)半抗原的特性選擇合適的方法，MBzP具有羧基，可以采用活潑酯法，羰二亞胺法和混合酸酐法進行偶聯(lián)。選擇偶聯(lián)方式時應(yīng)考慮半抗原的溶解度、穩(wěn)定性、結(jié)合鍵的位置以及適合的偶聯(lián)試劑等因素［10，11］。這三種方法都會存在一定的副反應(yīng)，本實驗采用活潑酯法進行偶聯(lián)是因為活潑酯法是對碳二亞胺法的改進，可避免蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)［12］。合成后的人工抗原經(jīng)過非變性凝膠電泳證實了完全抗原的偶聯(lián)成功，可進行下一步實驗。

細胞融合是制備單克隆抗體的關(guān)鍵步驟，本實驗采用聚乙二醇法進行細胞融合。（1）PEG分子量對細胞融合的影響：PEG的分子量越大粘性越大，毒性也越大，如加入PEG時出現(xiàn)細胞凝聚現(xiàn)象可能與其分子量有一定的關(guān)系，即分子量越大出現(xiàn)凝聚塊也越大。融合可選用的PEG的分子量在1000－6000均能達到一定的融合效果，但不同分子量的PEG所對應(yīng)的作用時間也不相同，分子量大的相對作用時間應(yīng)減少。目前，大多數(shù)選用分子量1000的PEG進行細胞融合，融合率穩(wěn)定且毒性相對小些。（2）PEG的作用時間對細胞融合的影響：PEG具有一定的毒性，作用時間過長會對細胞造成一定的損傷，作用時間過短會使細胞融合不充分。經(jīng)試驗摸索作用時間為40－120 s內(nèi)可得到較好的融合效果。（3）PEG的p H對細胞融合的影響：一般PEG的p H在6.8－7.4之間即可，但也有報道顯示在偏堿條件下，p H＝8.0時的融合效果比較好［13］。（4）溫度對PEG的融合的影響：PEG在37－40℃的條件下有助于提高融合率，可能是因為溫度對細胞膜的流動性有一定的影響，隨著溫度的升高膜的流動性及通透性都會有所加強［14］。控制好細胞融合的條件是提高細胞融合率的前提保障，在細胞融合24 h后可粗略看下細胞是否有污染，HAT是否有效的抑制了骨髓瘤細胞的生長，因為HAT存放時間過長可能導(dǎo)致其失效，如果發(fā)現(xiàn)細胞孔內(nèi)細胞的數(shù)量有明顯增多的現(xiàn)象說明HAT失效，此時應(yīng)及時補加有效的HAT，如無任何異常情況，盡量不去觀察或移動細胞。在融合的第6 d進行換液，因為此時細胞處于生長緩慢的潛伏期，比較脆弱，過早換液或經(jīng)常移動不利于細胞的穩(wěn)定生長。在隨后的細胞培養(yǎng)中也可能會出現(xiàn)細胞生長緩慢，逐漸皺縮，死亡的狀態(tài)，所以，在細胞的生長期應(yīng)密切注意觀察細胞的狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)異常，應(yīng)及時對所用試劑包括培養(yǎng)基的血清含量、培養(yǎng)基的酸堿度、雙抗的濃度及細胞培養(yǎng)箱中CO2的含量、溫度和水分是否充足等進行排查，及時找出原因挽救細胞［15］。

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