Infliximab對急性壞死性胰腺炎大鼠腸道屏障損害的保護作用

歐婭 賈林 邱嘉華 李偉冬 黃耀星 聶玉強

·論著·

Infliximab對急性壞死性胰腺炎大鼠腸道屏障損害的保護作用

歐婭 賈林 邱嘉華 李偉冬 黃耀星 聶玉強

目的探討infliximab(TNF-α單抗)對大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)并多器官功能障礙綜合征(MODS)模型腸動力及腸屏障損害的保護作用。方法30只SD大鼠按完全隨機法分為假手術組、ANP組和infliximab組。經胰膽管逆行注射4.5%牛磺膽酸鈉制備大鼠ANP并MODS模型，infliximab組于建模后6 h經尾靜脈給予infliximab 8 mg/kg體重，對照組胰膽管逆行注射等量生理鹽水。24 h后處死大鼠，檢測血淀粉酶、TNF-α水平及二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量；胰腺及小腸組織常規病理檢查及評分；碳素墨水法測小腸推進率。結果對照組、ANP組、infliximab組血清淀粉酶水平分別為(1125±331)、(11024±2203)、(545±30)U/L；TNF-α水平為(12.1±4.0)、(107.6±18.5)、(75.8±5.9)U/L；胰腺病理評分為(2.25±0.38)、(14.1±0.22)、(3.93±0.67)分；小腸病理評分為(2.29±0.32)、(6.61±0.58)、(3.91±0.41)分；血清DAO含量為(87.88±34.51)、(146.30±12.99)、(115.00±18.58) μg/L；D-乳酸含量為(1.50±0.49)、(2.32±0.35)、(2.02±0.25) mmol/L；小腸推進率為(0.64±0.04)%、(0.28±0.08)%、(0.52±0.09)%，各組間比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)。結論早期使用infliximab可有效改善ANP大鼠的胃腸動力功能及減輕腸屏障損害。

胰腺炎，急性壞死性； 腫瘤壞死因子； 單克隆抗體； Infliximab； 腸道屏障

重癥急性胰腺炎(SAP)發病機制中，TNF-α是一系列瀑布樣級聯炎癥反應的始動和促進因子，可導致腸屏障功能障礙，促使細菌和內毒素易位，最終導致多器官功能障礙綜合征(MODS)的發生。文獻報道[1-2]，實驗性急性壞死性胰腺炎(ANP)建模后6 h為抗炎癥介質治療窗。為此，本實驗用TNF-α單抗infliximab干預ANP大鼠，觀察其對ANP并MODS大鼠腸道屏障損害的保護作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

雌性SD大鼠30只，體重190～220 g，SPF級，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。按完全隨機法分成假手術組、ANP組和infliximab組。實驗前大鼠禁食12 h，不禁水。采用4.5%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)胰管內逆行注射的方法制備大鼠ANP并MODS模型[3]。假手術組向胰管內逆行注射等量生理鹽水。infliximab組大鼠于建模后6 h經尾靜脈注射8 mg/kg體重的infliximab(西安楊森公司)。建模后23.5 h經灌胃針給予碳素墨水灌胃，每只2.5 ml，30 min后處死大鼠并解剖，留取胰腺、小腸標本；腹腔靜脈采血，離心取血清，置-80℃冰箱保存。

二、檢測指標及方法

1．血清淀粉酶、TNF-α、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸水平檢測：采用酶聯耦合法測定血淀粉酶。ELISA法檢測血清TNF-α、DAO水平，試劑盒分別購自美津生物公司及R&D公司。采用改良分光光度法測定血清D-乳酸水平，試劑盒購自博世生物公司。

2．小腸推進率測定：將留取的腸管展于白紙上，以幽門為基點，無張力狀態下量取幽門括約肌至色素最前端及至盲腸的距離，以兩者百分比為小腸推進率，評價腸道動力。

3．組織學檢查：留取的大鼠胰腺及小腸組織常規行病理學檢查，由專一病理醫師閱片，并按照schemidt標準進行胰腺組織病理評分[4]，按照Chiu′s分級進行小腸組織病理評分[5]。

三、統計學處理

結 果

一、一般情況

假手術組大鼠一般情況良好，無死亡。ANP組大鼠出現呼吸急促、腹脹、豎毛、精神萎靡、反應遲鈍、無大便排出等表現，造模24 h內死亡3只。infliximab組大鼠一般情況較好，多數排稀便，造模24 h內死亡2只。

二、血清淀粉酶、TNF-α水平與胰腺病理改變

造模24 h后，假手術組、ANP組與infliximab組大鼠血清淀粉酶水平分別為(1125±331)、(11024±2204)、(545±30)U/L，各組比較差異均有統計學意義(F=21.76、21.49、24.36，P<0.05)；TNF-α水平分別為(12.1±4.0)、(107.6±18.5)、(75.8±5.9)U/L，各組比較差異也均有統計學意義(F=19.2、4.55、13.45，P<0.05)。假手術組胰腺輕度間質水腫，腺泡局部炎細胞浸潤；ANP組胰腺廣泛間質水腫，成堆腺泡壞死，大量出血及炎細胞浸潤；infliximab組胰腺損傷較ANP組有不同程度的減輕。假手術組、ANP組與infliximab組胰腺病理評分分別為(2.25±0.38)、(14.1±0.22)、(3.93±0.67)分，各組間比較差異均有統計學意義(F=0.589、5.215、8.223，P<0.05)。

三、血清DAO、D-乳酸水平的變化

假手術組、ANP組、infliximab組血清DAO水平分別為(87.88±34.51)、(146.30±12.99)、(115.00±18.58)μg/L，組間比較差異具有統計學意義(F=7.457、3.649、0.865，P<0.05)；D-乳酸水平為(1.50±0.49)、(2.32±0.35)、(2.02±0.25)mmol/L，各組間比較差異均有統計學意義(F=0.345、4.079、4.797，P<0.05)。

四、小腸病理改變及小腸推進率

造模24 h后，假手術組僅見腸道黏膜輕度水腫；ANP組腸道黏膜結構破壞，絨毛上皮水腫，可見局部上皮脫落及潰瘍形成，黏膜間質固有層毛細血管及淋巴管擴張，血管內可見積聚的紅細胞，并見少量圓形細胞浸潤；infliximab組腸黏膜改變程度較ANP組顯著減輕(圖1)。假手術組、ANP組、infliximab組大鼠小腸組織病理評分分別為(2.29±0.32)、(6.61±0.58)、(3.91±0.41)分，各組間比較差異具有統計學意義(F=0.305、0.026、0.147，P<0.05)；小腸推進率分別為(0.64±0.04)%、(0.28±0.08)%、(0.52±0.09)%，各組間比較差異也均有統計學意義(F=1.586、3.889、0.316，P<0.05)。

圖1假手術組(a)、ANP 組(b)、infliximab組(c)大鼠小腸病理改變 (HE ×10)

討 論

ANP是一個全身炎癥反應過程，早期的內毒素血癥刺激TNF-α釋放。TNF-α作為一種炎癥啟動因子，促進多種細胞因子產生[6]，致使腸黏膜細胞因缺血、缺氧、炎癥介質和細胞因子等因素而發生損傷，腸道屏障通透性升高，腸道內細菌及毒素通過受損的腸黏膜屏障發生易位，導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)，引起壞死的胰腺組織繼發感染和多器官功能不全[7]。DAO存在于哺乳動物的黏膜上層和絨毛上層細胞內，主要位于小腸黏膜，血中含量極低；而D-乳酸是細菌發酵的代謝產物，哺乳動物不具備將其分解代謝的酶系統。當腸黏膜通透性增加時,DAO及腸道中細菌產生的大量D-乳酸通過受損黏膜入血,故監測血中DAO和D-乳酸水平可及時反映腸黏膜損害程度和通透性變化，成為腸黏膜損害的重要指標[8-9]。

Infliximab為TNF-α的單克隆抗體，可抑制TNF-α的生理活性，阻止其誘導的瀑布樣級聯炎癥反應[10]。我們前期的研究顯示，建模后6 h使用infliximab可有效抑制TNF-α介導的SIRS、減輕胰腺炎癥和降低MODS發生率[11]。本實驗結果進一步顯示，infliximab可顯著減輕小腸病理損傷，增加ANP大鼠的小腸推進率、降低ANP大鼠血清DAO及D-乳酸水平，提示在抗炎癥介質治療窗口期應用infliximab有利于減輕TNF-α介導的腸道炎性反應，改善腸動力，減輕腸屏障損害，對ANP時的腸道屏障功能起保護作用。

[1] 賈林，邱嘉華，黃耀星，等.抗炎癥介質治療窗使用Infliximab對大鼠ANP并MODS模型的實驗療效.廣州醫藥，2011，42：3-4.

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[4] Schemidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute panereatitis for evaluating therapy. Ann Surg, 1992, 215:44-56.

[5] Kuo CK,Li WJ, Mauck RL, et al. Cartilage tissue engineering：its potential and uses. Curr Opin Rheumatol，2006，18：64-73.

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[7] Rahman SH，Ammofi BJ，Holmfield J，et al．Intestinal hypoperfusion contributes to gut barrier failure in severe acute pancreatitis. J Gastrointest Surg, 2003, 7：26-35.

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[9] 黎君友,呂藝,付小兵,等. 二胺氧化酶在創傷后腸道損傷中變化及意義.中國危重病醫學雜志,2000,12:482-484.

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[11] 賈林，陳奕金，黃耀星，等.重癥急性胰腺炎大鼠模型腹腔內壓和血TNF-α的時相改變及規律. 中華胰腺病雜志，2010，10 ：106-108.

Infliximabonintestinalbarrierinjureinratswithacutenecrotizingpancreatits

OUYa,JIALin,QIUJua-hua,LIWei-dong,HUANGYao-xing,NIEYu-qiang.
DepartmentofGastroenterology,FirstMunicipalPeople′sHospitalofGuangzhou,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510180,China

JIALin,Email:jialin@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the effects of infliximab (TNF-α monoclonal antibody) on intestinal barrier injury in ANP complicated with MODS in a rat model.MethodsThirty SD rats were randomly divided into sham operation group (SO), ANP group and infliximab treatment group. Sodium taurocholate (4.5%) was injected into the pancreatic duct to induce ANP complicated with MODS model. Infliximab (8 mg/kg) was injected via tail vein in 6h after modeling in infliximab group. Same amount of 0.9% NS was injected into the pancreatic duct in SO group. After 24 h of modeling, all rats were sacrificed, intestine and pancreas samples were collected for pathologic examination. The blood samples were harvested. The serum levels of amylase, TNF-α, diamine oxidase(DAO), D-lactate, and the rate of carbon propelling in ileum were measured.ResultsThe serum levels of amylase were (1125±331), (11024±2203), (545±30)U/L in SO group, ANP group and infliximab group; the serum levels of TNF-α were (12.1±4.0), (107.6±18.5), (75.8±5.9)U/L; the pathological scores of pancreas were 2.25±0.38, 14.10±0.22, 3.93±0.67, the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05). The pathological scores of intestine were 2.29±0.32, 6.61±0.58, 3.91±0.41; the DAO levels were (87.88±34.51),(146.30±12.99), (115.00±18.58)ng/ml; the D-lactate levels were (1.50±0.49), (2.32±0.35), (2.02±0.25)mmol/L; and the rates of carbon propelling in ileum were (0.64±0.04)%, (0.28±0.08)%, (0.52±0.09)%, the difference among the 3 groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsInfliximab can effectively prevent dysfunction of intestinal barrier and improve motility in ANP rats.

Pancreatitis, acute necrotizing; Tumor necrosis factor-alpha; Monoclonod antibodies; Infliximab; Intestinal barrier function

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.015

廣東省中醫藥局科研課題(008006)、廣州市中西醫結合科研課題(2008A02)

510180 廣州醫學院附屬廣州市第一人民醫院消化內科

賈林，Email:jialin@medmail.com.cn

2011-04-25)

(本文編輯：屠振興)