高效液相色譜法測定薇依霜中維生素E和羥苯乙酯含量

傅若秋，孟德勝，盧來春，余孟君，歐陽冰，鞠 樺

(1.中國人民解放軍第三軍醫大學第三附屬醫院，重慶 400042; 2.安微蚌埠醫學院藥學系，安徽 蚌埠 233030)

薇依霜為醫院傳統護膚制劑，具有防止皮膚萎縮、保濕防皺、營養皮膚、抗衰老等作用。其主要成分為維生素E(含量為2%)，且含有羥苯乙酯(含量為0.1%)作為防腐劑。為對其進行質量控制，筆者參照有關文獻方法[1-2]，采用高效液相色譜(HPLC)法測定了維生素E和羥苯乙酯的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

Gold System高效液相色譜儀(美國貝克曼)，包括125泵、166紫外檢測器;Sartorius BT 25S型電子分析天平(德國賽多利斯);RE-201C型恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司);KQ-50B型超聲波清洗儀(昆明市超聲儀器有限公司)。維生素E對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100062-200608);羥苯乙酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100847-200501);薇依霜(第三軍醫大學第三附屬醫院自制，批號分別為091112，091217，091123);甲醇(色譜純，SK Chemicals公司);水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

維生素E測定色譜條件:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇;紫外檢測波長:285 nm;流速:2.0 mL/min;進樣量:20μL;柱溫:室溫。羥苯乙酯測定色譜條件:Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇 -水(45∶55);紫外檢測波長:258 nm;流速1.0 mL/min;進樣量:20μL;柱溫:室溫。

2.2 溶液配制

精密稱取維生素E對照品0.024 9 g，置25 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解定容，得質量濃度為0.996 g/L的維生素E對照品溶液。精密稱取羥苯乙酯對照品0.010 8 g，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解定容，作為對照品貯備液;精密吸取對照品貯備液5 mL，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，得質量濃度為21.6μg/mL的羥苯乙酯對照品溶液。精密稱取薇依霜0.1 g，置10 mL量瓶中，加適量無水乙醇溶解，超聲處理1 h，冷卻至室溫，定容，搖勻，微孔濾器(0.22μm)濾過，續濾液作為供試品溶液。測定維生素E時，供試品溶液不用稀釋;測定羥苯乙酯時，供試品溶液需用無水乙醇稀釋2倍。按處方比例配制缺維生素E的制劑，再按供試品溶液制備方法制成不含維生素E的陰性對照品溶液。按處方比例配制缺羥苯乙酯的制劑，再按供試品溶液制備方法制成不含羥苯乙酯的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性考察:分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結果見圖1、圖2。可見，待測成分與其他物質分離良好，分離度大于1.5，維生素E和羥苯乙酯的保留時間分別為13.6 min和18.6 min，陰性對照品溶液色譜在待測成分相應位置無干擾峰，表明其他成分對待測成分的測定無干擾。

圖1 維生素E高效液相色譜圖

圖2 羥苯乙酯高效液相色譜圖

線性關系考察:分別精密吸取維生素E對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加無水乙醇定容，配制得5個不同梯度的對照品工作溶液(0.099 6，0.199，0.299，0.398，0.498 g/L)，按2.1項下色譜條件分別進樣，記錄維生素E峰面積，以峰面積(A)對質量濃度(C，g/L)進行線性回歸，得回歸方程 A=32.241 8 C+0.166 9，r=0.999 5(n=5)。結果表明，維生素E進樣質量濃度在0.099 6～0.498 g/L范圍內與峰面積線性關系良好。分別精密吸取羥苯乙酯對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加無水乙醇定容，配制得5個不同梯度的對照品工作溶液(2.16，4.32，6.48，8.64，10.80μg/mL)，按2.1項下色譜條件分別進樣，記錄羥苯乙酯的峰面積，以峰面積(A)對質量濃度(C，μg/mL)進行線性回歸，得回歸方程 A=2.122 2C+0.01031，r=0.9997(n=5)。結果表明，羥苯乙酯進樣質量濃度在2.16～10.80μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:取維生素E高(0.398 g/L)、中(0.299 g/L)、低(0.199 g/L)3個質量濃度的對照品溶液，按2.1項下色譜條件于1 d內連續進樣5次，以及連續5 d分別進樣，考察日內精密度和日間精密度。結果日內精密度 RSD＜1.18%(n=5)，日間精密度 RSD＜1.72%(n=5)。取羥苯乙酯高(8.64μg/mL)、中(6.48μg/mL)、低(4.32μg/mL)3個質量濃度的對照品溶液，按2.1項下色譜條件于1 d內連續進樣5次，以及連續5 d分別進樣，考察日內精密度和日間精密度。結果日內精密度RSD＜1.57%(n=5)，日間精密度 RSD＜2.45%(n=5)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，室溫放置 0，6，12，24 h，依法進樣測定峰面積。結果維生素E峰面積的 RSD=1.67%，羥苯乙酯峰面積的 RSD=1.23%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為091112)5份，依法制備供試品溶液并進樣，記錄峰面積。結果維生素E峰面積的 RSD=1.91%(n=5)，羥苯乙酯峰面積的 RSD=1.57%(n=5)。

加樣回收試驗:精密稱取已知維生素E含量的同一批樣品1 g(批號為091112)共9份，每3份為一組，分別加入不同質量濃度維生素E對照品溶液1.0 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液并進樣，計算加樣回收率。精密稱取已知羥苯乙酯含量的同一批樣品0.03 g(批號為091112)共9份，每3份為一組，分別加入不同質量濃度羥苯乙酯對照品溶液各1.0 mL，按2.2項下方法制備供試液品溶液并進樣，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 維生素E與羥苯乙酯加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取薇依霜樣品3批，按2.2項下制備供試液品溶液，按2.1項下的色譜條件進樣測定，計算維生素E和羥苯乙酯的含量。結果維生素E和羥苯乙酯含量分別為標示量的(99.9±0.72)%和(98.84±2.87)%(n=3)。

3 討論

曾考察了乙腈-甲醇對維生素E的分離效果，發現維生素E的保留時間隨乙腈含量的增加而延長，當乙腈為100%、流速為1.5 mL/min時，保留時間達43.5 min。而用甲醇作流動相、流速為1.5 mL/min時，保留時間為18.5 min，當流速增加到2.0 mL/min時，保留時間降到13.6 min，且峰形較好。因此本試驗選擇甲醇為流動相，并將流速設為2.0 mL/min。

羥苯乙酯測定時，考察了不同比例甲醇-水作為流動相時的分離效果，當甲醇-水為50∶50時，羥苯乙酯與樣品中的干擾物質(主要為香精)的色譜峰重疊，無法分離;當甲醇-水為45∶55、流速為 1.0 mL/min時，可以較好分離，保留時間為18.6 min。

曾采用乙醇為溶劑、80℃水浴溶解、冷藏后離心取上清液的方法，但試驗中發現樣品分散溶解不完全，且離心分離效果不好，上清液中不溶性雜質不易去除，容易堵塞色譜柱。后改為超聲促溶并用微孔濾膜過濾的方式處理樣品，通過加樣回收試驗證明該方法穩定、可靠。

[1]胡守蓮，范玉峰.HPLC法測定維生素E搽劑中維生素E的含量[J].中國當代醫藥，2009，16(10):5-6.

[2]簡炎林，鄒國芳.醫院制劑中防腐劑羥苯乙酯的含量測定[J].中國藥房，2009，20(13):1 016-1 017.