紫外分光光度法測(cè)定弱視明口服液中總多糖含量

梁學(xué)政，唐勇琛，呂建偉，陳惠紅，陸玉婷

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)院，廣西 柳州 545001;2.廣西中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2008級(jí)研究生，廣西 南寧 530001)

弱視明口服液是廣西柳州市中醫(yī)院通過(guò)臨床實(shí)踐研制出的純中藥制劑，由熟地黃、黃精、枸杞子、陳皮、石菖蒲等6味中藥組方，具有益腎填精、養(yǎng)肝明目、開(kāi)竅寧神之功效，用于兒童神經(jīng)發(fā)育不良、近視、遠(yuǎn)視、散光等造成的弱視。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，熟地黃多糖具有滋陰、益智、增強(qiáng)人體造血機(jī)能、調(diào)節(jié)免疫等作用[1]，黃精多糖可調(diào)節(jié)血糖、提高人體免疫功能、抗疲勞等[2]，枸杞子多糖可提高人體免疫功能、降糖調(diào)脂、抗疲勞、抗衰老、保肝等[3]，因此，多糖為該制劑的主要有效成分之一。筆者采用苯酚-硫酸法[4-8]對(duì)弱視明口服液中的總多糖進(jìn)行含量測(cè)定，為更深入地研究弱視明口服液提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-1601型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);CQX25-6型超聲波清洗機(jī)(中國(guó)北京創(chuàng)新德超聲電子研究所);KR80-2型沉淀離心機(jī)(上海分析儀器廠)。D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110833-200904);弱視明口服液(柳州市中醫(yī)院藥劑科自制，批號(hào)為 20110513，20110514，20110515);苯酚、濃硫酸等其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備

取苯酚100 g，加鋁片0.1 g、碳酸氫鈉0.05 g混合，常壓蒸餾，收集182℃餾分，稱取該餾分5.0 g，置100 mL容量瓶中，加新鮮蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后置棕色試劑瓶中，即得5%苯酚溶液，冷藏，避光保存。精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的 D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品40.4 mg，置100 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.404 g/L的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密吸取弱視明口服液1 mL，加水稀釋至50 mL，從中另取2 mL蒸干，80%乙醇洗滌，離心(3 000 r/min)10 min，傾去上清液，用80%乙醇洗滌兩次，再用水溶解沉淀，合并殘留在蒸發(fā)皿上的沉淀一并過(guò)濾，收集濾液后，稀釋并定容至100 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)確定

分別吸取一定量的葡萄糖對(duì)照品溶液，顯色后在280～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果葡萄糖對(duì)照品和供試品的最大吸收峰位一致，均在490 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。因此，本試驗(yàn)選用490 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。分別精密吸取以上溶液各2.0 mL，置具塞試管中，加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速沿壁加入濃硫酸5.0 mL混勻，40℃水浴加熱20 min，置冷水浴中冷卻至室溫，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(另用純化水隨行做空白試驗(yàn))。以葡萄糖質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 A=15.571X+0.026，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.008 08～0.048 48 g/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一葡萄糖對(duì)照品溶液2 mL，置25 mL試管中，依法重復(fù)測(cè)定5次。結(jié)果的 RSD=0.25%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液2 mL，置25 mL試管中，依法在120 min內(nèi)重復(fù)測(cè)定9次，每隔15 min測(cè)定1次。結(jié)果平均吸光度為0.314 5，RSD=0.15%(n=9)，表明供試品溶液中總多糖在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn):精密吸取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果的 RSD=0.60%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):精密吸取6份已知含量的樣品溶液(以葡萄糖計(jì)量為0.027 7 g/L)各1 mL，再準(zhǔn)確加入1 mL已知質(zhì)量濃度的 3 組葡萄糖對(duì)照品溶液(0.023 1，0.026 0，0.033 1 g/L)，混勻。取混勻液依法測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 總多糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

精密吸取3批樣品1 mL，依法制備供試品溶液并測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算口服液中總多糖含量(以葡萄糖計(jì))。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

目前，由于國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室條件的限制，苯酚-硫酸法被廣泛應(yīng)用于多糖的含量測(cè)定[4-8]。多糖在被濃硫酸水合時(shí)，產(chǎn)生的高溫使其迅速水解成單糖，反應(yīng)迅速完全，并能迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成有色化合物，在490 nm波長(zhǎng)處有特征吸收，且形成顏色的深淺與其含量成正比。故可采用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，然后通過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多糖的含量。

另外，試驗(yàn)樣品用80%乙醇處理，消除了親脂性雜質(zhì)、單糖、低糖和苷類成分的干擾，故可純化多糖。

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