三種胰腺癌細胞株Mesothelin的表達及成瘤速度的比較

潘璜 吳洪玉 陳士躍 劉敬禹 邵成偉 田建明

·論著·

三種胰腺癌細胞株Mesothelin的表達及成瘤速度的比較

潘璜 吳洪玉 陳士躍 劉敬禹 邵成偉 田建明

目的比較3種人胰腺癌細胞株在體外和裸鼠體內(nèi)Mesothelin的表達及裸鼠皮下種植瘤生長速度的差異。方法培養(yǎng)人胰腺癌細胞株SW1990、BxPC3、PANC1，取對數(shù)生長期分別注射于裸鼠左腋窩皮下，每周測量裸鼠皮下種植瘤的長、短徑，計算體積，SW1990、BxPC3組裸鼠觀察3周，PANC1組裸鼠觀察5周；用蛋白質(zhì)印跡法分別檢測3種細胞及裸鼠皮下種植瘤組織中的Mesothelin表達，用免疫組化染色檢測3種裸鼠皮下種植瘤組織中Mesothelin表達。結(jié)果人胰腺癌細胞株體外Mesothelin表達的強弱順序是BxPC3>PANC1>SW1990，體內(nèi)種植瘤組織表達的強弱順序是SW1990>BxPC3>PANC1。3種人胰腺癌細胞種植于裸鼠皮下的成瘤率均為100%，各組腫瘤的生長速度順序為SW1990>BxPC3>PANC1。結(jié)論不同人胰腺癌細胞株Mesothelin的表達量不同，裸鼠皮下種植瘤的生長速度亦不同，兩者無相關(guān)性。

胰腺腫瘤； 細胞系，腫瘤； Mesothelin蛋白； 小鼠，裸； 印跡法，蛋白質(zhì)； 免疫組織化學

近來研究發(fā)現(xiàn)，Mesothelin蛋白表達于胰腺癌細胞膜上，而正常胰腺細胞及其他原發(fā)性胰腺疾病時則不表達，因而對于胰腺癌具有較高的特異性，成為研究早期診斷、靶向治療胰腺癌的分子標靶之一。由于各實驗所使用的細胞株多不相同，使得結(jié)果在一定程度上缺乏統(tǒng)一性。因此本研究采用常用的3種胰腺癌細胞株，對各細胞株Mesothelin表達及其在裸鼠體內(nèi)的成瘤情況進行比較，探討它們之間的關(guān)聯(lián)，希望能為基于胰腺癌細胞Mesothelin表達的實驗研究提供有價值的參考信息。

資料與方法

一、細胞株及實驗動物

人胰腺癌細胞株SW1990、BxPC3、PANC1由第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室饋贈，常規(guī)體外培養(yǎng)、傳代。BALB/C裸小鼠購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，雌性，4～5周齡，體重(18±2)g，SPF級，飼養(yǎng)環(huán)境恒溫25～27℃，恒濕45%～50%。

二、裸鼠皮下成瘤實驗

取3株對數(shù)期細胞，分別用PBS調(diào)整細胞懸液密度至2×107/ml。將18只裸鼠按完全隨機法分為3組，每組6只，分別將SW1990、BxPC3及PANC1細胞懸液0.2 ml種植于左腋窩皮下，接種后分籠飼養(yǎng)。每周用游標卡尺測量各腫瘤長(a)、短(b)徑，按瘤體積=a×b2×0.4的公式計算[1]，并繪制生長曲線。根據(jù)腫瘤生長速度，SW1990、BxPC3組裸鼠飼養(yǎng)3周，PANC1組裸鼠飼養(yǎng)5周后處死，摘取皮下種植瘤。

三、Mesothelin表達的檢測

取對數(shù)生長期細胞，提取細胞總蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞mesothelin蛋白表達。鼠抗人Mesothelin一抗購自美國SANTA CRUZ生物技術(shù)公司，工作濃度1∶200。

取皮下種植瘤組織，采用蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化法檢測Mesothelin蛋白表達。蛋白質(zhì)印跡法所用一抗同上，免疫組化所用一抗為美國R&D公司產(chǎn)品，工作濃度1∶100。所得圖像用Imagel軟件作半定量分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白表達量。

四、統(tǒng)計學處理

3組裸鼠皮下腫瘤第3周的體積均數(shù)采用ANOVA檢驗，3組間的差異采用SNK檢驗。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、種植瘤的生長情況

裸鼠成瘤率100%，病理檢查均證實為胰腺癌(圖1)。各組種植瘤平均體積及生長曲線見表1、圖2。

表1 裸鼠皮下種植瘤各周平均體積(mm3)

圖1SW1990(a)、BxPC3(b)、PANC1(c)細胞的種植瘤(上)及病理(下)改變(HE ×100)

圖2 3組種植瘤生長曲線

二、Mesothelin表達

SW1990、BxPC3、PANC1細胞株均有Mesothelin蛋白表達(圖3a)，表達量分別為0.76±0.03、1.14±0.08、1.02±0.05，以SW1990表達最低，它們的種植瘤組織Mesothelin表達量分別為2.26±0.17、0.20±0.03、0.06±0.01，以SW1990細胞種植瘤表達最高，PANC1最低(圖3b)。SW1990細胞種植瘤呈強陽性染色，BxPC3及PANC1種植瘤僅見少數(shù)細胞弱陽性染色(圖4)。

圖3胰腺癌細胞株(a)和種植瘤組織(b)的mesothelin表達(蛋白質(zhì)印跡法)

圖4SW1990(a)、PANC1(b)及BxPC3(c)細胞種植瘤組織Mesothelin表達(免疫組化染色 ×400)

討 論

Mesothelin是一種分化抗原，在正常人體組織中只有胸膜、心包和腹膜上的間皮細胞表達[2-3]。既往報道，某些人類腫瘤，如間皮瘤、卵巢癌等Mesothelin異常高表達。2001年Argani等[4]首次報道胰腺導管腺癌高表達Mesothelin mRNA及蛋白，而正常胰腺組織無表達。隨后得到許多研究的證實[5-8]。

本研究結(jié)果顯示，3株人胰腺癌細胞均有Mesothelin蛋白表達，但表達的量有差異。它們的種植瘤亦均有Mesothelin表達，但表達量與體外實驗結(jié)果不同。體外實驗以SW1990表達量最低，而體內(nèi)種植瘤則以SW1990表達量最高，這一方面反映機體對腫瘤細胞基因表達具有調(diào)控作用，另一方面表明不同的腫瘤細胞對機體的反應也不一致。

裸鼠種植瘤模型是研究人體腫瘤的一種較為理想的模型，在臨床研究中廣泛應用，是最能反映人類胰腺癌生物學特性的“活試管”[9-10]。應用直接皮下細胞注射法制作裸鼠種植瘤的成功率高達80%～

100%[11]。本研究結(jié)果顯示，裸鼠成瘤率達100%。但3種不同細胞株的瘤體積差異具有統(tǒng)計學意義，SW1990細胞種植瘤平均體積較PANC1細胞種植瘤約大17倍，BxPC3種植瘤平均體積也較PANC1種植瘤約大6倍；即使5周后PANC1種植瘤體積仍然小于僅3周的SW1990及BxPC3種植瘤。

SW1990細胞種植瘤組織的Mesothelin表達量較其他兩株細胞的種植瘤顯著上調(diào)，提示Mesothelin參與體內(nèi)癌細胞的增殖，其機制有待進一步研究。

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[2] Chang K, Pastan I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:136-140.

[3] Chang K, Pastan I, Willingham MC. Isolation and characterization of a monoclonal antibody, K1, reactive with ovarian cancers and normal mesothelium. Int J Cancer, 1992,50:373-381.

[4] Argani P, Iacobuzio-Donahue C, Ryu B, et al. Mesothelin is overexpressed in the vast majority of ductal adenocarcinomas of the pancreas: identification of a new pancreatic cancer marker by serial analysis of gene expression (SAGE). Clin Cancer Res, 2001,7:3862-3868.

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Comparisonofexpressionofmesothelinamongthreekindsofpancreaticcancercelllinesanddevelopmentspeedintheirnudemousemodels

PANHuang,WUHong-yu,CHENShi-yue,LIUJing-yu,SHAOCheng-wei,TIANJian-ming.

DepartmentofRadiology,LushanSanatoriumofPLA,Jiujiang332000,ChinaCorrespondingauthors：SHAOCheng-wei,Email：cwshao@sina.com;TIANJian-ming,Email:tianjianming1952@hotmail.com

ObjectiveTo compare the mesothelin expressions in 3 human pancreatic cancer cell lines between in vitro and in vivo and the developing speed among the subcutaneous tumors implanted with the 3 human pancreatic cancer cell lines in nude mice.MethodsThe human pancreatic cancer cell lines (SW1990, BxPC3 and PANC1) were cultured and then were implanted subcutaneously into left axillas of nude mice. The volumes of these subcutaneous tumors were recorded every week to estimate their developing speed. The mice implanted with SW1990 and BxPC3 cells were observed for three weeks, while the mice implanted with PANC1 cell were observed for five weeks. The Western blot method was used to measure the expressions of mesothelin in the 3 kinds of cells and subcutaneous tumors, while immunohistochemical staining was applied to determine the expressions of mesothelin in 3 kinds of subcutaneous tumors.ResultsThe sequence of quantities of expressions of mesothelin in these cell lines in vitro were BxPC3>PANC1>SW1990, and the sequence of quantities of expressions in vivo were SW1990>BxPC3>PANC1. One handrued percent of the tumors grew out successfully, and the sequence of speeds of their growth was SW1990>BxPC3>PANC1.ConclusionsThe mesothelin expressions among 3 kinds of pancreatic cancer cell line are different. The developing speeds of tumors originated from different subcutaneous tumors in nude mice are also different, and there is no association between them.

Pancreatic neoplasms; Cell line, tumor; Mesothelin protein; Mice, nude; Blotting, western; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.011

國家自然科學基金(30970801)

332000 江西九江，解放軍廬山療養(yǎng)院放射科(潘璜)；第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科(吳洪玉)，放射科(潘璜、陳士躍、劉敬禹、田建明、邵成偉)

邵成偉，Email：cwshao@sina.com；田建明，Email：tianjianming1952@hotmail.com

2012-08-07)

(本文編輯：屠振興)