小鼠胰腺星狀細胞TLR-9的表達及意義

范昕 侯雯躋 王旭青 盧曠逸 馬小艷 張建新

·短篇論著·

小鼠胰腺星狀細胞TLR-9的表達及意義

范昕 侯雯躋 王旭青 盧曠逸 馬小艷 張建新

近年來研究發現，胰腺纖維化及胰腺癌耐藥與胰腺星狀細胞(PSCs)有關，具體機制尚不清楚[1-3]。有文獻報道，肝星狀細胞表達TLR-9，并通過TLR-9介導肝纖維化[4]。PSCs與肝星狀細胞相似，但其是否表達TLR-9尚不知曉。本研究旨在了解PSCs的TLR-9表達，探討TLR-9對PSCs功能的影響。

一、材料與方法

1．小鼠PSCs分離培養：清潔級昆明小鼠，體重20 g左右，雌雄不限，由江蘇大學動物實驗中心提供。參考Bachem等[5]及李波靜等[6]大鼠PSCs分離方法，并加以改進。主要操作步驟：取昆明種小鼠，消毒3 min后剖腹，迅速切除胰腺,放入盛有預冷PBS的培養皿中，剔除胰腺被膜及血管組織，將其剪至約1 mm×1 mm×1 mm大小，然后將組織塊均勻涂抹在預先包被多聚賴氨酸的培養瓶瓶底，于5% CO2的培養箱靜置30 min，待組織塊貼壁后用預熱的PBS輕輕沖洗一次，加入含有20%胎牛血清(Gibco公司)及胰酶抑制劑的DMEM培養液5 ml，繼續常規培養，第一天換液，以后隔天換液，約1周左右PSCs鋪滿瓶底60%～70%時傳代。

2．TLR-9蛋白表達的檢測：小鼠胰腺組織TLR-9表達采用免疫組化方法檢測，細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性。PSCs的TLR-9表達采用蛋白質印跡法檢測。兔抗鼠TLR-9抗體及HRP標記的羊抗兔IgG均購自SANTA CRUZ公司，工作濃度1∶200。

3．細胞增殖檢測：采用MTT法。將PSCs均勻接種至96孔板，每孔104個細胞，分為對照組、激動劑ODN1826(終濃度2.5 μg/ml，Invivogen公司)組、激動劑ODN1826+拮抗劑ODN2088(終濃度5 μg/ml，Invivogen公司)組，每組設5個復孔。隔天換液，分別培養1、2、3、4、5 d，每孔加入 20 μl 5% MTT(Sigma公司)，繼續培養4 h，上酶標儀測各孔A490值。

4．一氧化氮(NO)檢測：將PSCs均勻接種至6孔板，每孔105個細胞，同上述分為對照組、ODN1826組、ODN1826+ODN2088組，培養72 h。收集上清，采用NO試劑盒(南京建成公司)檢測NO水平，按照試劑盒說明書操作。

5．統計學處理：所有數據均采用SPSS13.0進行統計。

二、結果

1．PScs的狀態特征：組織塊植入后24 h,PSCs從胰腺間質中爬出,呈三角形或星形，同時胞質內可見脂肪滴。隨著培養時間的推移，脂滴逐漸消失，傳代后，體積變大，突起豐富,呈典型的“稻草把樣”(圖1)。

2．小鼠胰腺組織及PSCs的TLR-9表達：小鼠胰腺組織及PSCs均表達TLR-9(圖2)。

圖1 小鼠PSCs培養第3天(a)和傳代后2 d(b)的形態(×100)

圖2 小鼠PSCs的TLR-9表達(a免疫組化，×400；b蛋白質印跡法)

3．PSCs增殖的變化：對照組小鼠PSCs培養1～5 d的A490值分別為0.133±0.002、0.336±0.01、0.472±0.008、0.610±0.02、0.638±0.02；ODN1826組分別為0.130±0.002、0.268±0.004、0.397±0.01、0.429±0.01、0.497±0.02，自第2天起較同時間點親本細胞增殖顯著降低(F值分別為0.754、7.250、12.494、22.061、12.833，P值分別為0.510、0.025、0.003、0.000、0.002)；ODN1826+ODN2088組細胞增殖分別為0.131±0.001、0.318±0.01、0.44±0.006、0.593±0.02、0.613±0.01，與同時間點親本細胞增殖無顯著差異(P值分別為0.476、0.368、0.060、0.590、0.470，圖3)。

圖3 各組小鼠PSCs的生長曲線

4．PSCs的NO合成量變化：對照組、ODN1826組、ODN1826+ODN2088組細胞的NO合成量分別為(30.28±0.21)、(22.87±0.65)、(29.41±0.65)μmol/L，ODN1826組較親本細胞顯著減少(F=148，P=0.000)，而ODN1826+ODN2088組與親本細胞無顯著差異(P=0.114)。

討論正常胰腺組織中PSCs占4%，位于小葉間和腺泡周圍，呈靜止狀態[7]。在胰腺慢性炎癥及胰腺惡性腫瘤中PSCs可被激活，活化的PSCs增殖能力及遷移能力較前均明顯提高[8]。大量研究表明，胰腺纖維化與PSCs密切相關。通過多種細胞因子與炎性介質如TGF-β1、PDGF等的參與，不同的信號轉導通路如磷脂酞肌醇3激酶(IP3)途徑和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)途徑的轉導，從而激活PSCs，并最終形成纖維化[9]。

胰腺癌的病理特征之一是進行性纖維化及腫瘤粘連形成，這與細胞外基質中PSCs的增殖關系密切[10-11]。在體外，胰腺癌細胞與基質細胞共培養可以誘導胰腺癌細胞耐藥；PSCs也可以被胰腺腫瘤細胞激活[11-12]。這些都提示PSCs與胰腺癌的發展有協同關系，PSCs支持腫瘤細胞生長、侵襲及耐藥，同時腫瘤細胞激活PSCs。兩者協同作用，通過正反饋機制導致胰腺癌的高度惡性的生物學特征。

目前認為，胰腺纖維化及胰腺癌耐藥的形成是一個以胰腺星狀細胞活化為核心的復雜的病理過程[11]。因此對PSCs生物學特性的深入研究意義深遠。有研究發現，PSCs細胞表達Toll樣受體[13]，如TLR-2、TLR-4，但未見胰腺星狀細胞表達TLR-9的報道。在本研究中，通過免疫組化及蛋白質印跡法證實了PSCs表達TLR-9。體外實驗表明，PSCs分泌的NO可刺激胰腺腫瘤細胞分泌胰腺癌耐藥相關因子IL-1β[14]。本研究將分離培養的PSCs分別加入TLR-9的激動劑及拮抗劑，結果顯示TLR-9激動劑可明顯減弱PSCs的增殖能力，并有效減少NO的合成。加入抑制劑后上述效應被抑制，表明PSCs有TLR-9受體存在，激活PSCs的TLR-9受體，能減少PSCs對NO的分泌并抑制PSCs的增殖。

通過激活PSCs的TLR-9受體改變其生物學特性。這對于研究胰腺纖維化有重要意義。目前，TLR-9減少PSCs對NO

的分泌并抑制PSCs的增殖的機制尚不清楚。我們正在進行相關實驗，試圖了解其過程中關鍵的細胞因子或炎癥介質以及相關的信號轉導通路。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.021

國家自然科學基金(81070287)；鎮江市2009年度科技計劃(科技支撐-社會發展)(SH2009013)；江蘇大學臨床發展基金(JLY2010127)

212001 鎮江，江蘇大學附屬醫院普外科(范昕、王旭青、張建新)；江蘇大學臨床醫學院(侯雯躋、盧曠逸、馬小艷)

張建新，Email:zhangjx1818@163.com

2012-02-07)

(本文編輯：呂芳萍)