羅格列酮對急性壞死性胰腺炎及其肺損傷保護作用的實驗研究

蔡篤雄 陳衛昌 曾仕平 湯凈

羅格列酮對急性壞死性胰腺炎及其肺損傷保護作用的實驗研究

蔡篤雄 陳衛昌 曾仕平 湯凈

重癥急性胰腺炎(series acute pancreatitis,SAP)是臨床上常見的危重疾病，病情進展迅速，病死率高。因此，早期對SAP發病機制中的相關因素進行干預可能成為治療SAP的重要措施。

本研究應用過氧化物酶增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARγ)激動劑羅格列酮干預急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，探討羅格列酮對ANP及其肺損傷的保護作用。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：健康SD大鼠72只，體重200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(SCXK湘2009-0004)。按完全隨機法分為ANP組、羅格列酮組(干預組)及假手術組，每組24只。采用胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g體重(Sigma公司)方法建立ANP模型，羅格列酮組于制模前30 min腹腔內注射羅格列酮10 mg/kg體重(天津葛蘭素史克公司)。假手術組開腹后僅翻動胰腺即關腹。分別于術后3、6、12 h腹主動脈抽血后處死大鼠，留取胰腺及肺組織。

2．血淀粉酶、TNF-α、IL-6、氧分壓(PaO2)檢測：血漿淀粉酶采用全自動生化分析儀檢測；PaO2采用血氣分析儀檢測；血漿TNF-α、IL-6采用ELISA法檢測，試劑盒購自北京晶美生物工程公司，按說明書操作。

3．胰腺及肺組織病理檢查：按常規操作。

4．胰腺組織PPARγ mRNA和熱休克蛋白70(HSP-70)mRNA及肺組織TNF-α、黏附分子1(ICAM-1) mRNA表達檢測：采用RT-PCR法。PPARγ正義5′-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3′，反義5′-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3′，產物335 bp；HSP-70正義5′-GCTGACCAAGATGAAGGAGATC-3′，反義5′-GAGTCG-ATCTCCAGGCTGGC-3′，產物645 bp；TNF-α正義 5′-CTCAAAGACAACCAACTGGTGGTAC-3′，反義 5′-ACAGAGCAATGACTCCAAAGTAGACC-3′，產物312 bp；ICAM-1正義5′-ACCACAGCTGACAGGGAAATCG-3′，反義5′-AGAGGTCTTTACGCATGTCAACG-3′，產物282 bp。以β-actin(221 bp)為內參。引物由上海生工生物工程公司合成。反應條件： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s或1 min，50℃(PPARγ)或55℃(ICAM-1)或58℃(HSP-70)或60℃(TNF-α) 1 min，72℃ 1 min，30個循環，最后72℃7 min，4℃放置。產物電泳分離后掃描，以目的條帶與β-actin的灰度比值表示mRNA的相對表達量。

二、結果

1．血淀粉酶、TNF-α、IL-6、PaO2水平的變化：ANP組血淀粉酶、TNF-α、IL-6及PaO2水平較假手術組同時間點均顯著升高(P<0.05或<0.01)；干預組淀粉酶、TNF-α及IL-6水平均較ANP組同時間點明顯降低(P<0.05或<0.01)，6、12 h點的PaO2較ANP組明顯升高(P<0.05，表1)。

2．胰腺及肺組織病理改變：假手術組胰腺及肺組織無明顯病理改變。ANP組3 h時胰腺腺泡水腫，炎癥細胞浸潤明顯，可見局灶性腺泡細胞變性壞死，隨著時間的延長，病變呈進行性加重；干預組胰腺水腫、出血及炎癥細胞浸潤均較ANP組減輕。ANP組3 h時肺泡壁水腫，肺間質中性粒細胞及單核細胞浸潤，隨著時間的延長，病變逐漸加重；干預組肺泡壁、肺間質水腫及炎癥細胞浸潤均較ANP組明顯減輕(圖1)。

3．胰腺組織PPARγ、HSP-70 mRNA表達：干預組胰腺PPARγ、HSP-70 mRNA表達較假手術組及ANP組均顯著增強(P<0.05或<0.01)，而假手術組和ANP組間PPARγ mRNA表達無顯著差異。ANP組6、12 h點胰腺HSP-70 mRNA表達較假手術組明顯增加(P值均<0.05，圖2，表2)。

組別 時間(h)只數淀粉酶(U/L)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)PaO2(mmHg)假手術組381434±58.58±94.21±93.5±123 14.9014.272.4681641±63.19±92.19±92.4±683 16.6811.483.91281604±58.21±99.64±91.0±457 15.4018.236.5ANP組 384160±83.32±121.81±85.1±618b18.22a14.94b5.5b685194±106.49±132.49±77.9±1603b 29.13b23.76b6.0b1285875±96.38±146.01±68.6±1149b 20.98b18.61b7.4b干預組 383392±64.68±106.98±89.5±410bd19.46c11.24c5.0683585±83.64±110.71±85.4±1893c 15.96c17.52c7.1ac1284517±70.43±123.58±79.6±1493c 21.30c18.13ac11.7ac

注：與假手術組同時點比較，aP<0.05，bP<0.01與ANP組同時點比較，cP<0.05,dP<0.01。1 mm Hg=0.133 kPa

圖1對照組(a)、ANP組(b)、干預組(c)大鼠12 h時胰腺(上)和肺(下)組織的病理改變(HE ×100)

1：對照組；2：ANP組；3：干預組

4．肺組織TNF-α、ICAM-1 mRNA表達：假手術組肺組織TNF-α mRNA及ICAM-1 mRNA均呈微弱表達，ANP組的表達較假手術組明顯增加(P<0.01)，干預組又較ANP組顯著降低(P<0.05，表2，圖3)。

組別時點(h)只數PPARγmRNAHSP-70mRNATNF-αmRNAICAM-1mRNA對照組380.35±0.42±0.28±0.22±0.060.120.720.43680.37±0.44±0.30±0.24±0.090.110.590.621280.39±0.46±0.27±0.23±0.080.080.560.68ANP組380.33±0.45±0.51±0.44±0.100.110.66b0.50b680.35±0.58±0.94±0.85±0.560.12a0.91b0.47b1280.37±0.62±0.73±0.92±0.090.12a0.76b0.10b干預組380.47±0.61±0.43±0.39±0.13ac0.12bc0.58bc0.49bc680.65±0.73±0.81±0.76±0.13bd0.13bc0.12bc0.93bc1280.71±0.80±0.64±0.81±0.09bd0.15bc0.82bc0.13bc

注：與對照組同時點比較，aP<0.05，bP<0.01；與ANP組同時點比較，cP<0.05,dP<0.01

1：對照3 h組；2：ANP 3 h組；3：干預3 h組；4：ANP 6 h組；5：干預6 h組；6：ANP 12 h組；7：干預12 h組

圖3各組大鼠肺組織TNF-α mRNA(a)及 ICAM-1 mRNA(b)的表達

討論PPARγ是一個細胞增殖和炎癥反應的調節劑，可調節炎癥相關基因的表達，包括抑制IL-1、TNF-α、IL-6的產生及ICAM-1、NF-κB的表達等。Ivashchenko等[1]的研究發現，羅格列酮通過激活PPARγ而改善大鼠急性水腫型胰腺炎的病情。Rollins等[2]研究結果表明，雨蛙素可降低胰腺PPARγ的表達，使用PPARγ激動劑干預后，能恢復胰腺PPARγ的表達水平,PPARγ的表達與胰腺炎的嚴重程度和致炎細胞因子IL-6、TNF-α呈負相關。孫俊濤等[3]研究表明，羅格列酮通過激活PPARγ而減輕AP小鼠肝損傷。本研究結果顯示，羅格列酮處理后ANP大鼠胰腺PPARγ mRNA表達水平顯著增強，胰腺損傷減輕，與文獻結果一致。

HSP是指細胞在多種應激原，特別是高溫環境下被應激誘導合成的一組蛋白質，目前的研究主要集中在HSP70和HSP20。Grisé等[4]研究發現，高熱預刺激可誘導胰腺HSP-70表達，降低AP小鼠血清TNF-α、IL-6水平，減輕胰腺損傷，降低死亡率。Konturek等[5]用雨蛙素誘導大鼠AP模型，應用吡格列酮干預后，胰腺組織炎癥和損傷減輕。本研究中，羅格列酮組胰腺HSP-70 mRNA表達水平較ANP和假手術組顯著增加，提示羅格列酮也可能通過誘導HSP-70 mRNA的表達減輕胰腺的病理損傷。

細胞因子TNF-α、IL-6及ICAM-1在ANP及其肺損傷的發病機制中具有重要的作用。Cuzzocrea等[6]研究發現，羅格列酮通過減少細胞因子及炎癥介質的產生從而改善大鼠急性水腫型胰腺炎的病情。本研究中，羅格列酮組血漿TNF-α、IL-6水平較ANP組顯著降低，從而發揮抗炎癥效應。此外，羅格列酮組肺組織TNF-α、ICAM-1 mRNA表達水平較ANP組顯著降低，肺組織病理損傷明顯減輕，動脈PaO2升高，提示羅格列酮可能通過減少肺組織TNF-α及ICAM-1的產生從而減輕ANP合并的肺損傷程度。

[1] Ivashchenko CY,Duan SZ,Usher MG, et al.PPAR-gamma knockout in pancreatic epithelial cells abolishes the inhibitory effect of rosiglitazone on caerulein-induced acute pancreatitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,293:G319-G326.

[2] Rollins MD,Sudarshan S,Firpo MA,et al.Anti-inflam matory effects of PPAR-gamma agonists directly correlate with PPAR-gamma expression during acute pancreatitis.J Gastrointest Surg,2006,10:1120-1130．

[3] 孫俊濤，許剛，田克立.PPARγ激動劑對急性胰腺炎小鼠肝損傷的影響.中華胰腺病學雜志,2010,10:138-139.

[4] Grisé K,Kim F,McFadden D.Hyperthermia induces heat-Shock protein expression, reduces pancreatic injury, and improves survival in necrotizing pancreatitis.Pancreas, 2000,21:120-125.

[5] Konturek PC,Dembinski A,Warzecha Z,et al.Pioglitazone，a specific ligand of peroxisome proliferator-activated receptorgamma，protects pancreas against acute cerulein-induced pancreatitis.World J Gastroenterol,2005,11:6322-6329.

[6] Cuzzocrea S,Pisano B,Dugo L,et al.Rosiglitazone,a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,reduces acute pancreatitis induced by cemlein.Intensive Care Med,2004,30:951-956.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.020

海南省自然科學基金資助(807093)

570102 海口，海南醫學院附屬醫院消化內科(蔡篤雄、曾仕平、湯凈)；蘇州大學附屬第一醫院消化內科(陳衛昌)

陳衛昌，Email:weichangchen@126.com

2011-11-28)

(本文編輯：呂芳萍)