加巴噴丁對癲癇持續狀態大鼠海馬區神經元凋亡的影響

王克玲 劉新艷 王靜 施榮富 孫素真

癲癇發作，尤其是癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)不僅會增加癲癇患者的死亡率，還可造成神經元壞死和凋亡，長期影響癲癇患者的生存質量。因此在控制癲癇發作的同時防止神經元壞死和凋亡的腦保護劑成為研究重點。已發現一些抗癲癇藥具有抗凋亡作用［1］。加巴噴丁(gabapentin，GBP)是新在我國臨床使用的抗癲癇藥，它在抗癲癇同時是否具有神經元保護作用尚不清楚。本研究用戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)制造大鼠癲癇持續狀態癲癇模型，用GBP進行干預，用缺口末端標記法(TUNEL)法檢測海馬CA1、CA3區凋亡情況，以探討GBP的抗凋亡作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，體重(180±20)g，由河北省試驗動物中心提供，許可證號:SCXK(冀)2003-1-003。PTZ(美國 Sigma公司)。GBP(－)，TUNEL試劑盒(德國寶麗曼);顯微鏡［日本，BHS(Olympus)，脫水機(英國姍頓公司，Citadel 2000)］，包埋機(英國姍頓公司，Histocentres)，切片機(英國姍頓公司，AS-325)，顯微鏡(日本，BHS，Olympus)。

1．2 方法

1．2．1 分組:SD大鼠48只。隨機分為加巴噴丁組(GBP組)、加巴噴丁干預組(干預組)、戊四氮致癇組(PTZ組)、對照組，每組12只。

1．2．2 癲癇造模:SE 模型采用 PTZ 60 mg·kg－1·d－1腹腔注射，每24小時1次，每次注射后觀察30 min，觀察并記錄發作潛伏期、發作時行為表現和持續時間。大鼠驚厥行為表現采用Racine六級評價標準［2］。0級:無任何反應;Ⅰ級:濕狗樣抖動、面肌痙攣如眨眼、動須、及節律性咀嚼;Ⅱ級:頸部肌肉痙攣表現為點頭和(或)甩尾;Ⅲ級:一側前肢陣攣;Ⅳ雙側前肢陣攣伴站立;Ⅴ級:全身陣攣，失去平衡，跌倒。記錄發作時的行為表現。PTZ注射期間出現racineⅣ～Ⅴ級驚厥發作持續30 min，連續3 d未死亡者為SE成功，成功率75%。干預組于致癇成功后給予GBP灌胃，每天600 mg/kg;PTZ組照常喂養;GBP組給予未致癇大鼠GBP 600 mg/kg;對照組給予等體積0．9%氯化鈉溶液灌胃，所有喂藥均每天分2次給予，共5 d。

1．2．3 腦電圖描記:每組大鼠取2只進行腦電圖描記。用10%水合氯醛35 mg/kg給予大鼠腹腔注射麻醉，電極位置采用單極導聯法，記錄電極取兩根0．5寸針灸毫針分別刺入大鼠頂骨正中左右兩側頭皮下，再用導線連接于腦電圖機信號輸入盒，大鼠尾根部電極接地。先觀察行為學改變，然后描記腦電圖。

1．2．4 標本制備:10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉。輸液架距大鼠心臟高度控制在1．5 m。打開胸腔暴露心臟。找到心尖部，右手將灌流針刺破心尖部進針入主動脈。先以0．9%氯化鈉溶液快速灌流，直到從右心耳流出無色液體，腸系膜顏色變蒼白，肝臟顏色變淡黃，隨后灌注4℃預冷的4%的多聚甲醛溶液250 ml(0．1 mol/L PB配液，pH值7．4)。開始全速灌流，注意觀察大鼠，直到看到大鼠四肢突然緊張，肌肉陣攣，尾部卷曲上翹轉至其四肢肌肉抽搐停止，此時改為緩慢滴灌，至大鼠軀干、四肢、尾部僵直，肝臟變硬，說明達到固定目的。灌注時間控制在1．5 h左右。在視交叉和乳頭體處垂直橫斷腦組織，將含有海馬的中段腦組織置于4%多聚甲醛溶液。常規脫水、透明、石蠟包埋。用石蠟切片機，自視交叉向后冠狀位連續石蠟切片，切至出現海馬結構，每片厚度5 μm，每隔5張取1張，每個標本區2張用于TUNEL檢測。常規脫蠟入水、PBS洗3次、顯色、復染、常規脫水透明封固、鏡下觀察海馬組織細胞凋亡。

1．2．5 TUNEL檢驗凋亡陽性細胞:TUNEL染色嚴格按試劑盒說明書步驟進行操作。細胞核染成棕褐色的為凋亡陽性細胞。每張切片海馬部位分別至少觀察CA1和 CA3區10個具有代表性的高倍視野(100×)，計數每個視野中染色陽性的細胞數，計算出凋亡指數。細胞凋亡指數(apoptotic index，AI)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1．3統計學分析應用SPSS 13．0統計軟件，計量資料以±s表示，組間兩兩比較F檢驗，，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 3組SE大鼠海馬區CA1、CA3 TUNEL陽性細胞表達 細胞核內TUNEL染色陽性細胞呈棕黃色小塊和顆粒，對照組大鼠皮質可見散在的TUNEL陽性細胞，海馬區CA1和CA3區未見TUNEL陽性細胞。PTZ組與正常對照組比較，皮層細胞層排列紊亂，細胞層數減少，海馬區CA1和 CA3區可見TUNEL陽性細胞，細胞核呈現棕黃色，數量較多。干預組TUNEL陽性細胞明顯少于PTZ組。見圖1。

2．2 TNE陽性細胞數量分析 GBP組和對照組比較，差異無統計學意義(P＞0．05);PTZ組與對照組比較，PTZ組增多(P＜0．01);PTZ組與干預組比較，干預組凋亡細胞少于PTZ組(P ＜0．05)。見表1。

表1GBP對SE大鼠海馬神經AI的影響n=12，±s

表1GBP對SE大鼠海馬神經AI的影響n=12，±s

75±9 12±5 GBP組 10±5 PTZ組 88±12干預組組別 凋亡指數對照組

3 討論

過去認為癲癇發作造成的神經元損害主要表現為壞死，但近來國內外研究證實，癲癇發作后神經細胞的死亡方式除壞死外還存在凋亡［3］。還有人認為癲癇的主要病理改變是細胞凋亡［1］。癲癇動物模型的研究表明，癲癇發作可導致海馬、杏仁核、大腦皮質、丘腦及小腦等部位神經元喪失［4］，顳葉癲癇的腦邊緣區特別是海馬呈現顯著的神經元喪失。神經元喪失包括壞死、凋亡和不易區分的混合形態3種類型。在人類顳葉癲癇患者及各種SE模型中用形態學生化的方法均證實，神經元的損傷具有典型的凋亡征［5］。SE是指1次發作30 min以上，或30 min內發作多次，期間神智清醒者。SE對神經元的損傷更為嚴重，有學者認為癲癇持續時間長短決定海馬神經元死亡的形式［6］。本實驗用戊四氮致癲癇持續狀態后發現SE大鼠海馬區CA1C和A3的凋亡細胞顯著增加，提示SE確實能引起神經元的凋亡與有關研究報告一致［7］。既然細胞凋亡是SE后神經元丟失的重要形式。因此，阻斷凋亡就成為保護癲癇患者腦損傷的新途徑。

近十年新型抗癲癇藥已在我國廣泛應用，對這些抗癲癇藥物是否也具有抗凋亡的神經保護作用成為研究重點。已有研究認為托吡酯和左乙拉西坦具有保護因癲癇發作造成的海馬神經元損害［1，8］。GBP有無神經元保護作用尚不清楚。本實驗用發現PTZ制造的SE模型海馬CA1和CA3區凋亡細胞顯著多于對照組，提示SE確實可以引起神經元凋亡的發生，而加用GBP后，凋亡減輕，提示GBP保護癲癇發作引起神經元凋亡。雖然GBP結構與神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)相似，但它并不通過GABA機制直接發揮作用，并不作用于GABA的受體，不代謝成GABA或GABA激動劑，也不抑制GABA的攝取和降解，它的抗癲癇機制尚不明確。目前研究認為GBP通過Na+依賴性通道通過血腦屏障，結合于谷氨酸占優勢的大腦皮質、海馬及小腦的分子層，影響神經細胞膜的氨基酸轉運而起到抗癲癇作用［9］。它在本實驗中顯示出抗凋亡作用是否和托吡酯一樣也是通過拮抗興奮性氨基酸的毒性作用還有待于進一步研究。

圖1 3組SE大鼠海馬區CA1、CA 3 TUNEL陽性細胞表達

隨著對癲癇患者生活質量的重視，發現SE后腦損傷的發病率日益增高，有關SE中神經元保護的研究也不斷取得進展，但癲癇發作所致的腦損傷機制相當復雜，各種因素相互影響。目前人們已將SE后神經元損傷的研究重點轉移至線粒體和基因［10，11］，認為線粒體是調控SE后神經元死亡的核心環節，線粒體的損傷、細胞色素C的釋放和caspase-3的激活是神經元損傷的最后共同通路。基因的不正常表達也是癲癇性腦損傷的重要途徑。這些發現為SE后腦保護治療開辟了新的前景。

1 紀建波，張慶柱，李倩，等．托吡酯對癲癇持續狀態大鼠海馬神經元損傷的影響．山東醫藥，2006，46:23-24．

2 Racine RJ．Modification of seizure activity by electrical stimulation．II．Motor seizure．Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32:281-294．

3 丁瑛雪，高麗．癲癇的腦損傷研究進展．國際兒科學雜志，2007，34:17-20．

4 Bertram EH，Scott C．The pathological substrate of limbic epilepsy:neuronal loss in the medial dorsal thalamic nucleus as the consisterrt change．Epilepsia，2000，41:53-58．

5 Sarkar R，Shin DH，Liu H，et al．Patterns of status epilepticus induced neuronal injury during development and long term cones quences．Neurosci，1998，18:8382-8393．

6 陳玉華．癲癇發作誘導神經元死亡的機制．黃石理工學院學報，2011，27:58-61．

7 謝煒，于禮建，鮑勇，等．柴胡總皂貳對戊四氮致痛大鼠海馬神經細胞凋亡．新中醫，2006，38:87-88．

8 王學峰，張喻，彭希，等．癲病持續狀態中海馬神經元的保護:現狀及展望．中國神經免疫學和神經病學雜志，2010，17:95-98．

9 李紅霞，王孝蓉，趙志剛．抗癲癇藥物加巴噴丁臨床藥物．治療雜志，2006，4:49-53．

10 何斌，于會青．癲癇持續狀態臨床分析．河北醫藥，2011，33:2830．

11 Tan Z，Sankar R，Tu W，et al．Immunohistochemical study of p53-associated proteins in rat brain following lithium-pilocarpine status epilepticus．Brain Res，2002，929:129-138．