苦參素對肝星狀細(xì)胞膠原合成能力的影響

張建榮 劉志剛 李麗華

近年來關(guān)于苦參素的實(shí)驗(yàn)研究很多，大多是在抗病毒方面［1，2］。大量臨床實(shí)踐證實(shí)，苦參素可以阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化，但其作用機(jī)制及調(diào)節(jié)途徑尚不明確。肝纖維化以肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量增生沉積為特征，是各種慢性肝病所共有的病理特點(diǎn)，肝星狀細(xì)胞(HSC)是膠原合成和降解的關(guān)鍵細(xì)胞，苦參素可能是通過抑制HSC總膠原及Ⅰ型膠原的合成，從而產(chǎn)生抗肝臟纖維化作用的。

1 材料與方法

1．1 試劑及主要儀器 苦參素注射液為市售產(chǎn)品，由上海第一生化藥業(yè)公司生產(chǎn)。BMPI-1640培養(yǎng)基為美國Gibeo公司產(chǎn)品;無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司;纖維連接蛋白(FN)由上海醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞室提取并純化;3H-脯氨酸(3H-Pro)試劑盒購自中國原子能研究所;主要儀器有超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、LS6500液閃儀。

1．2 細(xì)胞系 HSC系CFSC由美國Greenwel教授建系并惠贈(zèng)，其表型為活化的HSC。

1．3 方法

1．3．1 細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞置于含8%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L 谷氨酰胺及1 mol/L HEPES 的BPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)均在呈指數(shù)生長的細(xì)胞中進(jìn)行，將肝星狀細(xì)胞以3×104/ml密度接種于2塊96孔培養(yǎng)板，一塊用于膠原合成的測定，另一塊用于蛋白的提取，每孔100 μl，使其在24 h內(nèi)達(dá)到近90%融合，換為不含血清的培養(yǎng)基使其同步化12 h，并分為:對照組、FN預(yù)刺激組(FN組)及苦參素干預(yù)組 (A、B、C、D、E、F組，苦參素濃度分別為 30、60、120、240、480、960 mg/L)，F(xiàn)N 組及苦參素干預(yù)組分別用60 μg/ml的 FN預(yù)刺激 HSC。用培養(yǎng)液倍比稀釋100 μl苦參素至終濃度分別為 30、60、120、240、480、960 mg/L，分別加入到A、B、C、D、E、F 6個(gè)干預(yù)組中，每組設(shè)6個(gè)副孔。

1．3．2 3H-Pro摻入法檢測總膠原及Ⅰ型膠原合成:將HSCs以1×105/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板并使其在24 h內(nèi)達(dá)到近90%融合，換為不含血清的培養(yǎng)基使其同步化12 h，并按上述方法分組，6復(fù)孔/組。同步化后按照上述方法轉(zhuǎn)染，同時(shí)加入3H-Pro至終濃度3 μCi/ml干預(yù)24 h。收集上清，每孔上清液等分為兩份分別移入2 ml Eppendorf管:一管加Ⅰ型膠原酶0．5 mg/ml，另一管為空白對照，置37℃恒溫作用3 h。3 h后每管加10%三氯醋酸500 μl沉淀膠原，并4℃，5 000 r/min，離心10 min去上清(去除游離3H-Pro)，并于每管加入2 ml閃爍液溶解沉淀物，置于閃爍杯，于液體閃爍記數(shù)儀上測定樣品cpm值。細(xì)胞內(nèi)膠原合成以Bq表示。按照下列公式計(jì)算:總膠原(Ⅰ型膠原合成量)(△cpm)=空白對照管cpm值－加入總膠原(Ⅰ型膠原合成量)后cpm值。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行兩兩比較，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 苦參素對HSC總膠原合成的影響 經(jīng)FN處理后，HSC總膠原合成在FN組顯著高于對照組(P＜0．01)，而在苦參素干預(yù)HSC 48 h后HSC總膠原合成較FN組下降(P＜0．05)。見表1。

2．2 苦參素對HSCⅠ型膠原合成的影響 經(jīng)FN處理后，HSCⅠ型膠原合成FN組顯著高于對照組(P＜0．01)，而在苦參素干預(yù)HSC 48 h后HSCⅠ型膠原合成較FN組下降(P＜0．05)。見表1。

表1HSC總膠原及Ⅰ型膠原的合成±s

表1HSC總膠原及Ⅰ型膠原的合成±s

注:與對照組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01

型膠原合成對照組 476±52 186±32組別 總膠原合成 ⅠFN組 798±32# 438±26#A組 712±75* 409±44*B組 683±24* 366±35*C組 669±61* 351±52*D組 575±72* 287±61*E組 517±92* 208±32*F組 496±39* 191±25*

3 討論

肝纖維化的實(shí)質(zhì)是機(jī)體對慢性肝損傷所產(chǎn)生的愈合反應(yīng)的失衡，表現(xiàn)為肝內(nèi)ECM合成與分解的失衡，ECM的成分以Ⅰ型膠原為主。HSC是肝臟合成ECM的最主要細(xì)胞，因此，HSC活化并合成大量膠原是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。MMP13是對Ⅰ型膠原起降解作用的明膠酶，主要降解基底膜中膠原，肝臟纖維化時(shí)沉積的膠原含有大量的Ⅰ型膠原，推測它們也可以調(diào)控肝臟的膠原代謝［3］。近年來關(guān)于苦參素的實(shí)驗(yàn)研究很多，大多是在抗病毒方面。大量臨床實(shí)踐證實(shí)，苦參素還可阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化。既往一些研究表明，苦參素可抑制肝星狀細(xì)胞的增殖［4］，從而產(chǎn)生抗纖維化作用，但其作用途徑仍不明確。本研究發(fā)現(xiàn)苦參素能抑制肝星狀細(xì)胞總膠原及Ⅰ型膠原的合成，由此可推測苦參素可能通過抑制肝臟總膠原和Ⅰ型膠原的合成，從而改善和逆轉(zhuǎn)肝臟纖維化。

1 Xiaobin G，Quancheng K，Yifan S，et al．Effect of oxymatrine on interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha serum levels in an experimental rat model of autoimmune encephalomyelitis．Neural Regeneration Research，2010，5:3969．

2 張建春，胡娟．阿德福韋酯聯(lián)合苦參素膠囊治療慢性乙型肝炎臨床研究．肝臟，2010，15:34-35．

3 Zhang M，Zhang JP，Ji HT，et al．Effect of six flavonoids on proliferation of hepatic stellate cells in vitro．Acta Pharmacol Sin，2000，21:253-256．

4 張汝建，盧興梅，國力，等．苦參素對肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響．泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30:23-24．