苦參素對肝星狀細胞膠原合成能力的影響

張建榮 劉志剛 李麗華

近年來關于苦參素的實驗研究很多，大多是在抗病毒方面［1，2］。大量臨床實踐證實，苦參素可以阻止甚至逆轉肝臟纖維化，但其作用機制及調節途徑尚不明確。肝纖維化以肝臟細胞外基質(ECM)大量增生沉積為特征，是各種慢性肝病所共有的病理特點，肝星狀細胞(HSC)是膠原合成和降解的關鍵細胞，苦參素可能是通過抑制HSC總膠原及Ⅰ型膠原的合成，從而產生抗肝臟纖維化作用的。

1 材料與方法

1．1 試劑及主要儀器 苦參素注射液為市售產品，由上海第一生化藥業公司生產。BMPI-1640培養基為美國Gibeo公司產品;無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司;纖維連接蛋白(FN)由上海醫科大學細胞室提取并純化;3H-脯氨酸(3H-Pro)試劑盒購自中國原子能研究所;主要儀器有超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、LS6500液閃儀。

1．2 細胞系 HSC系CFSC由美國Greenwel教授建系并惠贈，其表型為活化的HSC。

1．3 方法

1．3．1 細胞培養:細胞置于含8%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L 谷氨酰胺及1 mol/L HEPES 的BPMI1640培養液中，37℃、5%CO2條件下培養。每次實驗均在呈指數生長的細胞中進行，將肝星狀細胞以3×104/ml密度接種于2塊96孔培養板，一塊用于膠原合成的測定，另一塊用于蛋白的提取，每孔100 μl，使其在24 h內達到近90%融合，換為不含血清的培養基使其同步化12 h，并分為:對照組、FN預刺激組(FN組)及苦參素干預組 (A、B、C、D、E、F組，苦參素濃度分別為 30、60、120、240、480、960 mg/L)，FN 組及苦參素干預組分別用60 μg/ml的 FN預刺激 HSC。用培養液倍比稀釋100 μl苦參素至終濃度分別為 30、60、120、240、480、960 mg/L，分別加入到A、B、C、D、E、F 6個干預組中，每組設6個副孔。

1．3．2 3H-Pro摻入法檢測總膠原及Ⅰ型膠原合成:將HSCs以1×105/孔的密度接種于24孔培養板并使其在24 h內達到近90%融合，換為不含血清的培養基使其同步化12 h，并按上述方法分組，6復孔/組。同步化后按照上述方法轉染，同時加入3H-Pro至終濃度3 μCi/ml干預24 h。收集上清，每孔上清液等分為兩份分別移入2 ml Eppendorf管:一管加Ⅰ型膠原酶0．5 mg/ml，另一管為空白對照，置37℃恒溫作用3 h。3 h后每管加10%三氯醋酸500 μl沉淀膠原，并4℃，5 000 r/min，離心10 min去上清(去除游離3H-Pro)，并于每管加入2 ml閃爍液溶解沉淀物，置于閃爍杯，于液體閃爍記數儀上測定樣品cpm值。細胞內膠原合成以Bq表示。按照下列公式計算:總膠原(Ⅰ型膠原合成量)(△cpm)=空白對照管cpm值－加入總膠原(Ⅰ型膠原合成量)后cpm值。

1．4統計學分析應用SPSS 13．0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，應用最小顯著差異法(LSD)進行兩兩比較，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 苦參素對HSC總膠原合成的影響 經FN處理后，HSC總膠原合成在FN組顯著高于對照組(P＜0．01)，而在苦參素干預HSC 48 h后HSC總膠原合成較FN組下降(P＜0．05)。見表1。

2．2 苦參素對HSCⅠ型膠原合成的影響 經FN處理后，HSCⅠ型膠原合成FN組顯著高于對照組(P＜0．01)，而在苦參素干預HSC 48 h后HSCⅠ型膠原合成較FN組下降(P＜0．05)。見表1。

表1HSC總膠原及Ⅰ型膠原的合成±s

表1HSC總膠原及Ⅰ型膠原的合成±s

注:與對照組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01

型膠原合成對照組 476±52 186±32組別 總膠原合成 ⅠFN組 798±32# 438±26#A組 712±75* 409±44*B組 683±24* 366±35*C組 669±61* 351±52*D組 575±72* 287±61*E組 517±92* 208±32*F組 496±39* 191±25*

3 討論

肝纖維化的實質是機體對慢性肝損傷所產生的愈合反應的失衡，表現為肝內ECM合成與分解的失衡，ECM的成分以Ⅰ型膠原為主。HSC是肝臟合成ECM的最主要細胞，因此，HSC活化并合成大量膠原是肝纖維化發生發展的中心環節。MMP13是對Ⅰ型膠原起降解作用的明膠酶，主要降解基底膜中膠原，肝臟纖維化時沉積的膠原含有大量的Ⅰ型膠原，推測它們也可以調控肝臟的膠原代謝［3］。近年來關于苦參素的實驗研究很多，大多是在抗病毒方面。大量臨床實踐證實，苦參素還可阻止甚至逆轉肝臟纖維化。既往一些研究表明，苦參素可抑制肝星狀細胞的增殖［4］，從而產生抗纖維化作用，但其作用途徑仍不明確。本研究發現苦參素能抑制肝星狀細胞總膠原及Ⅰ型膠原的合成，由此可推測苦參素可能通過抑制肝臟總膠原和Ⅰ型膠原的合成，從而改善和逆轉肝臟纖維化。

1 Xiaobin G，Quancheng K，Yifan S，et al．Effect of oxymatrine on interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha serum levels in an experimental rat model of autoimmune encephalomyelitis．Neural Regeneration Research，2010，5:3969．

2 張建春，胡娟．阿德福韋酯聯合苦參素膠囊治療慢性乙型肝炎臨床研究．肝臟，2010，15:34-35．

3 Zhang M，Zhang JP，Ji HT，et al．Effect of six flavonoids on proliferation of hepatic stellate cells in vitro．Acta Pharmacol Sin，2000，21:253-256．

4 張汝建，盧興梅，國力，等．苦參素對肝星狀細胞增殖及凋亡的影響．泰山醫學院學報，2009，30:23-24．