粉防己堿對(duì)雄黃所致小鼠免疫功能低下的影響

李祥華，高 林，余萬(wàn)桂，黃江榮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

張家均 (長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434000)

許甲鳳，杜亞明 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

粉防己堿對(duì)雄黃所致小鼠免疫功能低下的影響

李祥華，高 林，余萬(wàn)桂，黃江榮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

張家均 (長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434000)

許甲鳳，杜亞明 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探討雄黃中毒所致小鼠免疫功能低下后粉防己堿(Tet)的調(diào)節(jié)作用。方法：取小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，粉防己堿(tetrandrine，Tet)高、中、低劑量組，二巰基丙磺酸鈉(DMPS)組。正常對(duì)照組給予生理鹽水，模型組灌胃給予70mg/kg雄黃混液，Tet高、中、低劑量組分別腹腔注射給予Tet 98.0、49.0、24.5mg/kg，連續(xù)42d。采用重量法稱量小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量，以其質(zhì)量與體質(zhì)量之比作為胸腺和脾臟指數(shù)。Giemsa染色計(jì)數(shù)腹腔巨噬細(xì)胞(PMΦ)并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。用比色法測(cè)定紅細(xì)胞(RBC)裂解釋放的空斑形成細(xì)胞(PFC)量。觀察Giemsa染色后淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)并計(jì)算母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果：Tet能增加小鼠脾臟和胸腺的重量，增強(qiáng)小鼠PMΦ的吞噬能力(Plt;0.01)，提高小鼠溶血值，增加PFC數(shù)(Plt;0.01)，能提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(Plt;0.01)，且有一定劑量差異。結(jié)論：對(duì)于雄黃所致的小鼠免疫功能低下，Tet的免疫增強(qiáng)作用可能是能使胸腺和脾臟重量增加，PMΦ的吞噬能力增強(qiáng)，淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率升高及抗體能力加強(qiáng)等作用有關(guān)。

粉防己堿；雄黃；免疫調(diào)節(jié)劑

近年來(lái)，隨著人們對(duì)雄黃及雄黃復(fù)方的深入研究和廣泛的臨床應(yīng)用，雄黃受到廣泛關(guān)注。但臨床常有雄黃中毒甚至死亡的報(bào)道。雄黃中毒的反應(yīng)是多方面的，其表現(xiàn)為：影響蛋白質(zhì)酶的活性，損害神經(jīng)，影響脂質(zhì)過氧化物代謝，損傷組織器官，影響免疫功能，引起免疫力下降。此外，損害細(xì)胞染色體，阻止細(xì)胞正常分裂，麻痹血管平滑肌。前人有用粉防己治療其中毒，解除其毒性的報(bào)道。前期的研究作用表明，粉防己堿(Tetrandrine，Tet)對(duì)雄黃中毒動(dòng)物有促進(jìn)砷排泄作用[1]。作者以Tet作為解毒劑，對(duì)其免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物 Tet為江西銀濤制藥有限公司產(chǎn)品。雄黃購(gòu)自湖北省荊州市中藥材公司，經(jīng)荊州市藥品檢驗(yàn)所劉以民副主任藥師鑒定為產(chǎn)于湖南的雄黃正品。二巰基丙磺酸鈉(DMPS)注射液(上海天豐藥廠)，批號(hào)021201。

1.1.2動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(鄂)2004-0028。

1.1.3試劑 Giemsa.染液、淋巴細(xì)胞分離液，上海化學(xué)試劑廠，批號(hào) 070713；PRMI-1640、植物血凝素(PHA)，Sigma公司(美國(guó))，批號(hào) 3305RB560；L-谷氨酰胺，上海東風(fēng)化學(xué)試劑廠，批號(hào)0511143；小牛血清，杭州四季青生物工程公司，批號(hào)20070506。

1.1.4儀器 ThermoLabsystems Multisken M3 型酶標(biāo)儀，芬蘭；LD4-2A型低速離心機(jī)，北京離心機(jī)廠；765C型分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；Leica DMLB2型光學(xué)顯微鏡，德國(guó)；PG3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，華東電子管廠。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 取小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，雄黃(模型)組，模型+Tet高、中、低劑量組，模型+DMPS組，每組20只。

1.2.2給藥方法 除正常對(duì)照組外，各組每鼠每日上午ig給予雄黃70mg/kg，連續(xù)6周，實(shí)驗(yàn)期間，普通飼料喂養(yǎng)。中午12時(shí)停食不停水，下午18時(shí)Tet高、中、低劑量組分別ip給予98.0、49.0、24.5mg/kg的Tet注射液；DMPS組ip 7mg/kg的DMPS注射液。給藥6d后停藥1d為1個(gè)周期，連續(xù)6個(gè)周期。正常對(duì)照組給予同樣量的生理鹽水同法處理。

1.2.3小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)算 于給藥的最后一天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，剖腹，立即取脾臟、胸腺稱重，按文獻(xiàn)[2]方法計(jì)算每組動(dòng)物器官指數(shù)。

1.2.4小鼠PMΦ吞噬功能的測(cè)定 于給藥的最后一天，按文獻(xiàn)[2]方法每鼠ip 10%蛋白胨0.2ml，32h后ip新鮮雞RBC 0.5ml，30min后處死動(dòng)物，立即剖腹，洗出腹腔液，37℃溫育15min 后離心，取細(xì)胞懸液涂片，甲醇固定，Giemsa染色后在油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)MΦ。以MΦ吞噬雞 RBC 的吞噬百分?jǐn)?shù)和吞噬指數(shù)為指標(biāo)表示藥物對(duì)小鼠PMΦ吞噬功能的影響。

1.2.5小鼠空斑形成細(xì)胞(PFC)量的測(cè)定 于給藥的最后一天, 按方法[3]每鼠ip 5% SRBC 0.2ml，4d 后放血致死，取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液 ( 約5×106個(gè)/ml )。取該懸液0.5ml，加入0.2% SRBC和1∶10 小鼠血清各0.5ml，混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體作為空白對(duì)照，37℃ 溫育1h 后離心，取上清液比色(波長(zhǎng)r=413nm)，測(cè)定 RBC裂解釋放的PFC量 ( 以D143值表示 )。

1.2.6小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)算 于停藥后的次日，小鼠眼球取血，肝素抗凝。參考文獻(xiàn)[3]方法，取血0.1ml加入1.8ml滅菌的PRMI-1640(內(nèi)含20%小牛血清，30.0g/L谷氨酰胺1.0ml)，再加入PHA 0.1ml，37℃溫育3d后吸出血清，加8.5g/L NH4Cl 4ml，混勻后37℃水浴10min，離心。取沉淀物滴加于玻片上，Giemsa染色液染色，油鏡下觀察200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算其母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1Tet對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試藥三個(gè)劑量組均可增加脾臟和胸腺指數(shù)，與正常對(duì)照組比較，高、中劑量組局均有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)；與模型組比較，高、中、低三個(gè)劑量組亦顯示非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)。結(jié)果見表1。

表1 Tet對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.2Tet對(duì)小鼠PMΦ吞噬功能的影響

結(jié)果表明，Tet高、中、低三個(gè)劑量組均能提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指數(shù)。與正常組比較，Tet高、中劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)，低劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。與模型組比較，Tet高、中、低劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)。結(jié)果見表2。

表2 Tet對(duì)小鼠PMΦ吞噬功能的影響

2.3Tet對(duì)小鼠PFC的影響

結(jié)果表明，Tet各組均能提高小鼠溶血值，增加PFC數(shù)，與正常對(duì)照組比較，高劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)，中、低劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.05)。與模型組比較，高、中、低三個(gè)劑量組均有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)。結(jié)果見表3。

2.4Tet對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tet不同劑量均能提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。與正常對(duì)照組比較，Tet高劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)；中、低劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.05)。與模型組比較，Tet高、中、低三個(gè)劑量組也顯示出非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P均lt;0.01)。結(jié)果見表4。

表3 Tet對(duì)小鼠PFC的影響

表4 Tet對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

3 討 論

在上個(gè)世紀(jì)90年代，有人研究發(fā)現(xiàn)，Tet是一種天然的免疫抑制劑，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用。Tet可通過干擾細(xì)胞跨膜信號(hào)傳遞，抑制分裂原刺激淋巴細(xì)胞增殖、B細(xì)胞合成抗體及NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用。Tet還可通過下調(diào)T細(xì)胞蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制T細(xì)胞增殖，減少IL-2的分泌及下調(diào)T細(xì)胞激活抗原CD71的表達(dá)產(chǎn)生免疫均有抑制作用。Tet可劑量和時(shí)間依賴性的地引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、豚鼠肺巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系J774細(xì)胞活性喪失，抑制巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)，減少氧自由基的生成，下調(diào)多種炎性細(xì)胞因子的合成與釋放[4]。亦可劑量依賴性抑制內(nèi)毒素、PMA及二氧化硅誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞NF-KB的激活及NF-KB依賴性基因的表達(dá)，但對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子SP-1的DNA結(jié)合活性及SP-1依賴報(bào)告基因無(wú)影響，這一作用與抑制IKB降解的某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、清除氧自由基有關(guān)[5]。Tet還可顯著抑制N-甲酰基蛋氨酸、亮氨酸等誘導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)上調(diào)、自由基聚集及對(duì)纖維蛋白原粘附[6]。Tet在體內(nèi)外均有較好的免疫抑制作用，且與抗風(fēng)濕藥物具有協(xié)同作用，還可減少不良反應(yīng)，但其機(jī)制不同于其他抗風(fēng)濕藥[7]。

雄黃中毒后，機(jī)體的免疫功能下降。我們研究發(fā)現(xiàn)，Tet在促進(jìn)雄黃中毒動(dòng)物砷排泄時(shí)，能調(diào)節(jié)其免疫功能。研究結(jié)果表明，給予Tet不同劑量時(shí)，能增加小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指數(shù)，提高小鼠溶血值，增加PFC數(shù)，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。這表明Tet在治療雄黃中毒時(shí)，能發(fā)揮其雙重作用。

[1]李祥華，高林，余萬(wàn)桂，等. 粉防己堿對(duì)雄黃中毒大鼠尿砷血砷含量的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(24)：2083-2085.

[2] 李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991：155.

[3] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1433-1456.

[4] Pang L, Hoult J R. Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine, an antisilicosis alkaloid,accompanied by on overproduction of prostaglandins [J]. Biochem Pharmacol，1997，53(6)：773-779.

[5] Chen F，Lu Y，Demers L M，et al. Role of hydroxyl radical in silica-induced NF-kappa B activation in macrophages [J]. Ann Clin Lab Sci，1998，28(1)：1-8.

[6] Shen Y C，Chen C F，Wang S Y，et al. Impediment to calcium influx and reactive oxygen production accounts for the inhibition of neutrophil Mac-1 up-regulation and adhesion by tetrandrine [J]. Mol Pharmacol，1999，55(1)：186-191.

[7] Lai J H. Immunomodulatory effects and mechanism of plant alkaloid tetrandrine in autoimmune diseases [J]. Acta pharmacol Sin，2002，23(12)：1093-1099.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.001

R963

A

1673-1409(2012)01-R001-03

2011 10 25

湖北省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006AA301C34)

李祥華(1953)，男，湖北松滋人，教授，主要從事中醫(yī)藥學(xué)教學(xué)與研究工作。