氯沙坦抑制ROS/ERK1/2信號(hào)途徑減輕AGEs誘導(dǎo)的大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞增殖

鄭凌云 梁艷玲 梁靜文

（ 1 廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理學(xué)系，廣東，廣州 510006；2 中山大學(xué)中山眼科中心，廣東，廣州 510060）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖在糖尿病性血管并發(fā)癥中起關(guān)鍵作用[1]。高糖可誘導(dǎo)產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。AGEs可刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖并加速動(dòng)脈粥樣硬化以及冠脈再狹窄形成[2]，提示AGEs在糖尿病血管并發(fā)癥中有重要作用。

氨基胍（aminoguanidine，AG）可阻止糖基化終末產(chǎn)物形成[3]，在糖尿病性動(dòng)物模型中對(duì)血管損傷有保護(hù)作用，但其具有毒副效應(yīng)。因此尋找阻斷AGEs刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖作用的藥物有重要臨床意義。

氯沙坦（losartan，LV）是血管緊張素受體1特異阻斷劑。高糖處理血管平滑肌細(xì)胞可上調(diào)該受體mRNA和平滑肌細(xì)胞增殖[4]，在II型糖尿病小鼠[5]中AT1受體阻斷劑可抑制ROS并改善主動(dòng)脈的舒張功能，說(shuō)明糖尿病引起的血管損傷與AT1受體活化密切相關(guān)。但氯沙坦對(duì)AGEs引起血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用不明。本研究以果糖制備AGEs，觀察對(duì)大鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響并探討氯沙坦對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雄性SD大鼠（80～120g，合格證號(hào)0098406，中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；氯沙坦（純度≥98%，Sigma-Aldrich公司）；D-果糖（純度≥99%，上海生物工程有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco 公司）；CCK8試劑盒（上海同仁化學(xué)研究所）；DCF-DA（Sigma-Aldrich公司）； ERK1/2抗體（cell signaling technology公司）；細(xì)胞裂解液（millipore 公司）；牛血清白蛋白（純度≥98%，Sigma-Aldrich 公司）；β-actin抗體（boster bio-engineering technology）；ECL發(fā)光液（cell signaling technology 公司）。

1.2 糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的制備及鑒定

按文獻(xiàn)[6]用牛血清白蛋白（BSA；10mg/mL）在磷酸鉀緩沖液（200mmol/L，pH=7.4）中與D-果糖（250mmol/L）孵育。試劑用0.22μm濾膜過(guò)濾，37℃孵育6d。反應(yīng)產(chǎn)物用PBS透析48h除去未結(jié)合果糖。熒光分光光度儀測(cè)定產(chǎn)物熒光密度。蛋白濃度用BCA蛋白定量檢測(cè)。非糖化BSA用同樣方法制備，不加D-果糖。

1.3 腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定

斷頭取出大鼠腦基底動(dòng)脈移入預(yù)冷PBS中，分離血管外膜后將其剪成1～3mm3小塊接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清、100u/L青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)免疫熒光鑒定95%以上為平滑肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用3～8代細(xì)胞。

1.4 血管平滑肌細(xì)胞增殖的檢測(cè)

取第四代平滑肌細(xì)胞以2×104個(gè)/孔加入96孔板待貼壁，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。分別以AGEs，氯沙坦（1，5，10μmol/L）+AGEs處理細(xì)胞44h后每孔加20 μL的WST-8繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（450nm）處測(cè)各孔OD值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.5 平滑肌細(xì)胞中ROS檢測(cè)

細(xì)胞長(zhǎng)到約70%匯合時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基漂洗，加入10μmol/L的DCF-DA于37℃孵育30min。胰酶消化后懸于PBS中。用流式細(xì)胞儀在520nm檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm。

1.6 免疫印跡檢測(cè)平滑肌細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)

取各皿細(xì)胞，加蛋白裂解液。冰上震蕩裂解30min后離心取上清，行SDS-PAGE 電泳。電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，室溫封閉1h后孵育ERK1/2（1∶500）抗體4 ℃過(guò)夜，次日孵二抗室溫1 h，PBST 室溫洗脫。取發(fā)光底物溶液和增強(qiáng)劑溶液各0.25mL，加去離子水至5mL，暗室中使X 膠片感光。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度值，β-actin作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)以 表示，組間采用單因素方差分析，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血管平滑肌細(xì)胞的鑒定

培養(yǎng)1周后，可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊中爬出向周?chē)鷶U(kuò)展；約2周后出現(xiàn)典型的血管平滑肌細(xì)胞的“波峰波谷”狀生長(zhǎng)。免疫熒光法鑒定胞內(nèi)α-smooth muscle actin表達(dá)陽(yáng)性（圖1）。

圖1 A.培養(yǎng)1周后，平滑肌細(xì)胞從組織塊中爬出，成多角形，聚集分布（×100）；B陰性對(duì)照；C細(xì)胞內(nèi)α-SMC-actin抗原表達(dá)（×400）

2.2 AGEs和氯沙坦對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用

200mg/L的AGEs刺激48h后OD值與BSA組相比明顯增加（0.827±0.069 vs 0.364±0.052，P＜0.01）；BSA組與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＞0.05）；氯沙坦（5，10μmol/L）和AGEs共同孵育48h后OD值顯著降低，且10μmol/L的氯沙坦抑制作用更明顯（0.827±0.069 vs 0.381±0.058，P＜0.01）。提示AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖中有AT1的參與（表1）。

表1 不同濃度氯沙坦對(duì)AGEs誘導(dǎo)的腦血管平滑肌細(xì)胞增殖影響（±s，n=6）

表1 不同濃度氯沙坦對(duì)AGEs誘導(dǎo)的腦血管平滑肌細(xì)胞增殖影響（±s，n=6）

*P＜0.01 vs BSA對(duì)照組；#P＜0.01vs 1μmol/L氯沙坦+AGEs組；?P＜0.01 vs 5μmol/L氯沙坦+AGEs組

分組 CCK8值空白對(duì)照組（含0.1%胎牛血清）0.368±0.036 BSA對(duì)照組 0.364±0.052 AGEs組（200mg/L）0.827±0.069*1μmol/L氯沙坦+AGEs組 0.816±0.047*5μmol/L氯沙坦+AGEs組 0.658±0.064*#10μmol/L氯沙坦+AGEs組 0.381±0.058#?

2.3 氯沙坦對(duì)AGEs引起的細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCF-DA熒光反應(yīng)胞內(nèi)ROS生成。AGEs處理48h，胞內(nèi)ROS較空白對(duì)照組增高（P＜0.01）；BSA組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差別（P＞0.05）； 5μmol/L和10μmol/L氯沙坦可降低AGEs引起的ROS增多（P＜0.01），提示氯沙坦抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖與抑制ROS的生成有關(guān)（圖2）。

2.4 氯沙坦對(duì)AGEs引起的ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

Western blot顯示，BSA不影響ERK1/2蛋白表達(dá)，給予AGEs處理血管平滑肌細(xì)胞48h后ERK1/2表達(dá)升高（P＜0.01），氯沙坦5和10μmol/L降低ERK1/2的表達(dá)。提示AGEs引起ERK1/2表達(dá)增高與AT1受體活化相關(guān)（圖3）。

3 討 論

糖尿病引起的動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[7]。持續(xù)高糖可促進(jìn)體內(nèi)AGEs形成[1]，進(jìn)而參與糖尿病性血管疾病的發(fā)生。其中血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵[2]。

圖2 氯沙坦和AGEs對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

圖3 氯沙坦對(duì)AGEs引起血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

果糖結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，研究表明糖尿患者血清中果糖水平升高[8]；高果糖飲食還可使動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗和血管舒張功能紊亂[9]，提示果糖在誘發(fā)心血管疾病中有重要作用。但果糖制備的AGEs是否具有生物活性目前報(bào)道不多。我們發(fā)現(xiàn)果糖制備的AGEs可刺激平滑肌細(xì)胞細(xì)胞增殖。

研究表明[10]ROS生成是AGEs誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。我們發(fā)現(xiàn)果糖制備的AGEs明顯刺激細(xì)胞ROS生成，提示高果糖飲食對(duì)心血管損傷與AGEs生成有關(guān)；氯沙坦不僅抑制AGEs誘導(dǎo)的增殖且降低胞內(nèi)ROS，提示AGEs對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的損傷與AT1受體活化有關(guān)；ERK1/2表達(dá)在AGEs刺激后明顯增高而氯沙坦可抑制其表達(dá)，說(shuō)明果糖制備AGEs可能通過(guò)誘導(dǎo)AT1受體活化而引起ERK1/2蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖。

總之，果糖制備的AGEs同樣可引起血管平滑肌細(xì)胞增殖，其機(jī)制與AT1受體活化引起ROS生成和ERK1/2表達(dá)升高有關(guān)。但還需對(duì)相關(guān)分子機(jī)制做深入研究。

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