食管鱗癌中T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因1、血管內皮生長因子和CD31的表達及其相關性研究

王啟船 王 青 萬里新 屈中玉 盛 晶

河南省南陽市中心醫院腫瘤內科，河南南陽 473009

食管鱗癌中T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因1、血管內皮生長因子和CD31的表達及其相關性研究

王啟船 王 青 萬里新 屈中玉 盛 晶

河南省南陽市中心醫院腫瘤內科，河南南陽 473009

目的 檢測食管鱗癌中T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因1（Tiam1）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達特點，關注其對CD31標記的血管生成的作用。 方法 以87例食管鱗癌標本作為觀察組，72例正常食管黏膜組織作為對照組，采用流式細胞技術，分別檢測二組中Tiam1、VEGF和CD31的表達，探討其在不同臨床特征中的表達差別及相關性。 結果 Tiam1、VEGF和CD31蛋白在食管鱗癌中高表達，Tiam1、VEGF和CD31的表達與食管癌的浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移及PCNA的增殖指數密切相關；線性相關性分析顯示Tiam1、VEGF和CD31的表達之間均呈正相關性。 結論 Tiam1、VEGF和CD31在食管鱗癌中高表達，二者對腫瘤進展有重要作用，Tiam1和VEGF可能對促進CD31標記的新生血管內皮細胞的增殖有一定作用，聯合檢測Tiam1、VEGF和CD31蛋白可能與預后有關。

食管鱗癌；T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因1；血管內皮生長因子；CD31；流式細胞技術

食管鱗癌臨床常見，多數預后不良，由于其是富于血管的腫瘤，因此其血管生成在腫瘤生長和侵襲中具有重要作用。血管內皮生長因子（VEGF）是血管內皮細胞的特異有絲分裂原，可以促進血管內皮細胞的增殖，促進新生血管的生成，加速腫瘤生長及轉移[1]。食管鱗癌是富于血管的腫瘤，其發生發展時腫瘤細胞中VEGF的表達升高。CD31作為血管內皮的重要標志物，對新生血管內皮細胞標記的特異性強，可以有效地反應血管新生的程度。T淋巴瘤侵襲轉移誘導基因1（Tiam1）是一種鳥苷酸轉換因子，特異的激活與Rac相關的通路，改變腫瘤細胞形態和功能，誘導腫瘤的生長、侵襲和轉移[2-3]。本研究采用流式細胞技術，檢測食管鱗癌及正常食管黏膜組織中Tiam1、VEGF和CD31的表達特點，探討Tiam1、VEGF和CD31的關系，旨在為探討腫瘤的生物學行為提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月～2011年12月食管鱗癌手術后預留的新鮮標本作為觀察組，標本術后立即取材，置于-80℃冰箱中凍存待檢。納入均符合WHO關于食管鱗癌的診斷標準，并經病理主治醫師確診。本組患者術前均未進行任何放化療。本組共觀察87例，年齡39～78歲，平均57.7歲，其中男47例，女40例。同時選取距腫瘤邊緣5 cm外的正常食管黏膜組織標本72例作為對照組，取材及保存方法同上，本組中男40例，女32例，年齡40～78歲，平均56.9歲，兩組在性別、年齡等相關因素的比較上差異無統計學意義 （P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及流式細胞檢測方法

Tiam1、VEGF和CD31抗體的濃縮液均購自Santa Cruz公司。依不同稀釋比例進行預實驗，選取最佳染色的比例進行實驗。將凍存樣本取出，放在75%的酒精中固定24 h后，取出組織放在不銹鋼網上，用剪子搓碎后過濾，制備成單細胞懸液。取1 mL加入稀釋后的蛋白，嚴格按實驗要求的時間和順序加入一抗和二抗，經銅網過濾后應用流式細胞儀進行[4]。流式細胞儀依據所適應的條件調整相應參數，用系統自帶的軟件進行熒光的半定量分析。

1.3結果判斷標準

采用熒光指數（FI）表示Tiam1、VEGF和CD31蛋白的表達量。FI值計算公式為：

1.4 統計學方法

實驗數據經Excel表格整理，應用SAS 6.12統計軟件進行相關性檢驗，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組與對照組中的表達

Tiam1、VEGF和CD31在觀察組中的表達量明顯高于對照組（P<0.05），見表 1。

表1 觀察組與對照組中Tiam1、VEGF和CD31蛋白表達的比較（±s）

表1 觀察組與對照組中Tiam1、VEGF和CD31蛋白表達的比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別例數 Tiam1 VEGF CD31觀察組對照組87 72 1.43±0.31*1.00±0.24 1.54±0.28*1.00±0.24 1.44±0.28*1.00±0.25

2.2 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組不同臨床特征中表達的比較

Tiam1、VEGF和CD31的表達與食管癌的浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移及PCNA的增殖指數密切相關，見表2。

表2 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組不同臨床特征中表達的比較（±s）

表2 Tiam1、VEGF和CD31在觀察組不同臨床特征中表達的比較（±s）

臨床病理特征例數 Tiam1 VEGF CD31浸潤深度外膜以內外膜及以外P值分化程度高中+低P值淋巴結轉移48 39 1.35±0.24 1.54±0.22<0.05 1.46±0.31 1.64±0.31<0.05 1.36±0.26 1.56±0.32<0.05 47 40 1.35±0.22 1.55±0.21<0.05 1.45±0.28 1.65±0.26<0.05 1.34±0.34 1.56±0.35<0.05無有56 31 P值1.36±0.24 1.54±0.25<0.05 1.47±0.28 1.65±0.26<0.05 1.35±0.38 1.58±0.38<0.05 PCNA表達<25%≥25%P值52 35 1.34±0.23 1.55±0.29<0.05 1.48±0.22 1.64±0.28<0.05 1.34±0.35 1.58±0.24<0.05

2.3 Tiam1、VEGF和CD31在食管鱗癌中表達的關系

經Spearman等級線性相關性分析顯示，觀察組中Tiam1和 VEGF（r=0.45，P=0.013 5）、Tiam1 和 CD31（r=0.41，P=0.036 4）、VEGF 和 CD31（r=0.46，P=0.010 8）的表達均具有正相關性。

3 討論

食管鱗癌是實體腫瘤，其生長和轉移均依賴于新生血管的形成。血管內皮生長因子的發現及應用推動了腫瘤血管生成的研究[5]。食管鱗癌是一種富含血管的惡性腫瘤，血管生成機制復雜，并涉及到多種基因和蛋白的作用[6]。CD31是特異性的血管內皮細胞標志物，能很好地標記腫瘤發生發展過程中形成的新生血管。Tiam1作為Rho蛋白家族重要成員，是Rac1的特異性鳥苷酸轉換因子，能夠催化底物分子中GDP/GTP轉換，促進GDP的釋放以及與GTP的結合，進而激活Rac1，調節細胞骨架結構重組，促進細胞運動和遷移，參與基因表達調控、細胞增殖與凋亡。其次，Tiaml還可以介導蛋白復合物的形成以及Tiaml蛋白的細胞膜的定位，誘導膜皺褶形成，促進腫瘤的運動功能。再次，Tiaml對Racl蛋白起到明顯的活化作用，并對此通路具有正向調節的功能[7-8]。

流式細胞術檢測客觀性強，能準確地反應蛋白的表達程度?；诖?，本實驗通過流式細胞術半定量檢測食管鱗癌中Tiam1、VEGF和CD31的表達特點，結果顯示食管鱗癌中Tiam1、VEGF和CD31高表達，提示三者在腫瘤的發生中具有重要的促進作用；實驗顯示腫瘤中Tiam1、VEGF和CD31的表達均呈正相關，即Tiam1、VEGF和CD31可能具有正向協同作用。Tiam1可能通過Rac通路促進VEGF的高表達，進而促進CD31陽性血管內皮細胞的高表達，形成腫瘤性的新生血管。Tiam1也可能作為上游基因，直接調節VEGF的表達，促進血管內皮細胞的形成。Tiam1在誘導VEGF表達時增加，能明顯增加腫瘤間質毛細血管壁的通透性，起到雙重調節血管活性的作用。也有研究顯示，當Tiam1引起VEGF的激活后，通過與細胞膜上特異性受體結合而發揮多種生物學效應，特異性地促進內皮細胞分裂增殖，改變內皮細胞的基因表達方式，增加微血管的新生[9-10]。本實驗結果顯示食管鱗癌中Tiam1、VEGF和CD31的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度及PCNA的表達密切相關，由于腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度及PCNA均與患者的預后及指導治療相關，因此提示聯合檢測三種蛋白的表達可能對判斷預后有一定價值。

總之，Tiam1、VEGF和CD31蛋白的高表達對食管鱗癌的進展有重要的促進作用，Tiam1可能通過誘導VEGF高表達促進CD31陽性的血管內皮細胞新生，進而促進腫瘤的進展。聯合檢測Tiam1、VEGF和CD31的表達可能與患者的預后相關。

[1]劉愛東.流式細胞術檢測胃癌中血管內皮生長因子的表達及意義[J].中國中醫藥資訊，2011，3（5）：219.

[2]Yang W，Lv S，Liu X，et al.Up-regulation of Tiam1 and Rac1 correlates with poor prognosis in hepatocellular carcinoma [J].Jpn J Clin Oncol，2010，40（11）：1053-1059.

[3]Qi Y，Huang B，Yu L，et al.Prognostic value of Tiam1 and Rac1 overexpression in nasopharyngeal carcinoma[J].ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2009，71（3）：163-171.

[4]劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質金屬蛋白酶-9和CD105表達關系的研究[J].中國老年學雜志，2009，29（4）：886-887.

[5]龐久玲，劉愛東，張文江，等.CD34在大腸癌中的表達及意義[J].承德醫學院學報，2006，23（4）：339-341.

[6]朱宏，施瑞華，凌亭生，等.COX-2、VEGF蛋白在食管鱗癌發展過程中的表達變化及其與血管生成的關系[J].中華消化內鏡雜志，2005，22（3）：179-181.

The study of expression of Tiam1,VEGF and CD31 in esophageal squamous cell carcinoma and their correlations of them

WANG Qichuan WANG QingWAN Lixin QU Zhongyu SHENG Jing
Department of Oncology Medical,the Central Hospital of Nanyang City,He′nan Province,Nanyang 473009,China

Objective To detect the expression characteristics of Tiam1 and VEGF in esophageal squamous cell carcinoma,and pay close attention to angiogenesis role with markers of CD31.Methods 87 cases with esophageal squamous cell carcinoma were served as observation group.72 cases with normal esophageal mucosa were served as control group.The expressions of Tiam1,VEGF and CD31 were detected by FCM in the two groups.Their expressive relationship and different pathological characters were analyzed in the esophageal squamous cell carcinoma.Results The expression of Tiam1,VEGF and CD31 were higher in the neoplasm groups than in control group.Their expressions were correlated with invasion,differentiation,metastasis and PCNA expressions.Positive correlation were found between Tiam1,VEGF and CD31 in neoplasm by liner relationship analysis.Conclusion The higher expressions of Tiam1,VEGF and CD31 in esophageal squamous cell carcinama has the important role in tumor progression,and Tiam 1 and VEGF can promote the angiogenesis which expresses CD31 protein.The combined detection of Tiam1,VEGF and CD31 can judge the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma;Tiam1;VEGF;CD31;FCM

R735.1

C

1673-7210（2012）08（b）-0095-02

王啟船（1975.5-），男，本科，主治醫師；研究方向：腫瘤內科。

2012-03-26 本文編輯：衛 軻）