附子及關木通對辛伐他汀與吉非羅齊合用致橫紋肌溶解模型的影響及比較

吳 琪，王友群，杜晟南，史會杰，易英豪

（1.中國藥科大學 臨床藥學教研室，江蘇 南京210009；2.中國藥科大學 藥理研究室，江蘇 南京210009）

隨著生活水平不斷提高，人們的飲食營養也逐漸提升，患高血脂癥的病人越來越多。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）還原酶的抑制劑，此類藥物通過競爭性抑制內源性膽固醇合成限速酶（HMG－CoA）還原酶，阻斷細胞內羥甲戊酸代謝途徑，使細胞內膽固醇合成減少，有效降低總膽固醇及低密度脂蛋白（LDL－c）的含量。由于其降脂作用效果顯著、耐受性好而成為降脂首選藥物。但患者服用他汀類藥物后容易出現肌病不良反應，主要表現為肌痛、乏力、肌無力并伴隨著血液中與肌肉有關的酶如肌酸激酶（CK）含量的升高，嚴重者肌肉纖維壞死其內容物肌紅蛋白大量釋放到血中，引起橫紋肌溶解癥。橫紋肌溶解癥會導致腎損傷甚至腎衰，有生命危險。若他汀類藥物與另一類降脂藥物貝特類藥物合用，患者出現嚴重肌病不良反應的可能性將大大提升［1］，這可能與貝特類藥物影響了他汀類藥物在人體內的分解代謝有關［2］。本實驗選用他汀類藥物中出現肌病不良反應較多［3，4］，且使用廣泛的辛伐他汀（sv）加用貝特類藥物吉非羅齊（gfz）作為造模藥進行造模，以血清中CK值為主要指標，在小鼠身上模擬出橫紋肌溶解的模型。在此造模藥的基礎上，加給性大熱的附子和性寒的關木通，探究這兩味藥性相反的中藥對該模型有何影響并且進行差異比較，初步探討可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

雄性ICR小鼠138只，體重（30±2）g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖廠，動物合格證號：SCXK（蘇）2007－0001。實驗期間給予標準飼料，自由攝食飲水，室內溫度控制在20℃～25℃。

1.2 藥品與試劑

關木通飲片（批號：100401）購自南京市百信藥房，附子（批號：100726）購自南京市益豐大藥房；辛伐他汀片（批號：110244），由杭州默沙東制藥有限公司提供，吉非羅齊膠囊（批號：100107），由湖南千金湘江藥業股份有限公司提供。肌酸激酶（CK）、肌酐（Cr）、尿素氮 （BUN）、MDA、組織蛋白等試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

721分光光度計（上海第三分析儀器廠）；0412－1型低速離心機 （上海醫療器械有限公司手術器械廠）；BS－110－S型電子天平 （北京賽多利斯公司）。

2 方法

2.1 中藥水煎劑的制備

稱取適量附子，加入8倍體積的自來水，浸泡1h，武火煮沸后微沸1h，4層紗布過濾，收集濾液；殘渣加入6倍體積的自來水，微沸30min，亦過濾；合并兩次濾液，文火濃縮，得每毫升相當于0.3g附子的水煎液。以相同方法制備每毫升相當于0.5g關木通的水煎液。

2.2 分組及給藥

將小鼠隨機分為七組：正常對照組（C組，10只），低劑量模型組（M1組，16只），高劑量模型組（M2組，16只），M1＋關木通組（M1＋G組，24只），M1＋附子組（M1＋F組，24只），M2＋關木通組（M2＋G組，24只），M2＋附子組（M2＋F組，24只）。C組灌胃等體積飲用水。M1組從第8天起每天灌胃給予辛伐他汀（40mg·kg－1，晚上1次）及吉非羅齊（600mg·kg－1，早晚各1次），持續4周；M1＋G組和 M1＋F組從第1天起給予相應的中藥水煎劑，持續5周，從第8天開始加給造模藥辛伐他汀（40mg·kg－1，晚上1次）及吉非羅齊（600mg·kg－1，早晚各1次）。M2組從第8天起每天灌胃給予辛伐他汀（80mg·kg－1，晚上1次）及吉非羅齊（600mg·kg－1，早晚各1次），持續4周；M2＋G和 M2＋F組從第1天起給予相應的中藥水煎劑，持續5周，從第8天開始加給造模藥辛伐他汀（80mg·kg－1，晚上1次）及吉非羅齊（600mg·kg－1，早晚各1次）。各附子給藥組均為上午給藥，給藥體積為每10g體重0.1mL；各關木通給藥組均為上午給藥，給藥體積為每10g體重0.1mL，且每周連續給藥4天，停藥3天。

實驗過程中，某些組的死亡率過高就提前處理。具體的動物處理情況如下：①實驗第11天，M1＋G組的死亡率達到75%，故提前全部處理。②第17天，M2組和M2＋G組的死亡率分別達到56%和71%，故提前全部處理；M2＋F組處理部分，記做M2＋F（17天）組。③第21天，C組處理部分，記做C（21天）組；M1處理部分，記做 M1（21天）組；M1＋F組部分處理，記做 M1＋F（21天）組；M2＋F剩余動物全部處理，記做M2＋F（21天）。④實驗第35天，C組、M1組、M1＋F組剩余動物均全部處理，分別記做C（35天）組、M1（35天）組和 M1＋F（35天）組。

2.3 取材、樣品制備及指標測定

于實驗結束時，摘除小鼠眼球，取其全身血液致死，血樣在2 000r·min－1轉速下離心10min，然后取上層血清測定其中CK、Cr、BUN等指標的含量；解剖小鼠取右側腎臟，計算腎臟系數（單側腎臟質量／小鼠體重）；取左側腎臟組織，按質量體積比1∶9加入生理鹽水，在冰浴條件下制成腎組織勻漿，在3 000r·min－1轉速下離心10min后取上清液，測定其中MDA的含量及組織蛋白濃度；以相同方法制備肝組織勻漿，并測定其中MDA的含量及組織蛋白濃度。

2.4 統計學處理

3 結果

C（21天）組及C（35天）組兩批對照組的小鼠的腎系數、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cr）、腎組織蛋白含量、肝組織蛋白含量和肝組織蛋白中的MDA水平等指標無顯著性差異，說明該指標在正常小鼠中比較穩定，故將C（21天）組小鼠作為前三批處理的所有小鼠的對照組。而C（21天）組及C（35天）組兩批小鼠的血清肌酸激酶（CK）和腎組織蛋白中的 MDA水平有顯著性差異（P＜0.01、P＜0.05和P＜0.05），故只進行同一處理批次內的對比。

3.1 左腎系數

結果顯示，前三批處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M1＋G組、M2＋G組和M2＋F（17天）組的腎系數均顯著升高（P＜0.001、P＜0.001和P＜0.05），其他組與 C（21天）組相比無明顯差異；與M2相比，M2＋G組的腎系數顯著升高（P＜0.001），M2＋F（17天）組無明顯差異，僅略有升高趨勢。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組及 M1＋F（35天）組與C（35天）組相比腎系數無明顯差異；與 M1（35天）組，M1＋F（35天）組的腎系數無顯著性變化；與前一批次相比，M1（35天）組和 M1＋F（35天）組無顯著性變化。各組實驗數據見表1。

表1 各組小鼠腎系數（s，n為5～8）

表1 各組小鼠腎系數（s，n為5～8）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，與 C組比較；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001，與 M2組比較。

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3.2 血清肌酸激酶、肌酐、尿素氮

結果顯示，實驗17天處理的小鼠中，與M2組相比，M2＋F（17天）組小鼠的CK水平顯著降低（P＜0.05），M2＋G組無明顯差異，略有上升。實驗21天處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M1（21天）組、M1＋F（21天）組、M2＋F（21天）組CK水平均顯著升高（P＜0.001、P＜0.05和P＜0.001）；與 M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組的CK水平顯著降低（P＜0.05）；與 M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組CK水平顯著升高（P＜0.05）。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組的CK水平顯著升高（P＜0.05），M1＋F（35天）組無明顯差異，僅略有升高；與M1（35天）組比較，M1＋F（35天）組的CK水平顯著降低（P＜0.05）；與前一批次相比，M1（35天）組和 M1＋F（35天）組無顯著性變化。

在前三批處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M2＋G組、M2＋F（21天）組、M1（21天）組的Cr水平均顯著升高（P＜0.001、P＜0.001和P＜0.05）；與 M2組相比，M2＋G組的Cr水平顯著升高（P＜0.01），M2＋F（17天）組無明顯變化；與 M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組顯著降低（P＜0.05）；與 M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組Cr顯著升高（P＜0.05）。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組與M1＋F（35天）組的Cr水平均顯著升高（P＜0.01和P＜0.05）；與前一批次相比，M1（35天）組和M1＋F（35天）組Cr水平均無明顯變化。

在前三批處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M1＋G組、M2＋G組、M1（21天）組、M1＋F（21天）組的BUN水平均顯著升高（均為P＜0.05）；與M2組相比，M2＋G組的BUN水平顯著升高（P＜0.05），M2＋F（17天）組無明顯變化；與 M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組無明顯變化；與M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組BUN水平無明顯變化。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組與M1＋F（35天）組的BUN水平均無明顯變化；與前一批次相比，M1（35天）組和M1＋F（35天）組BUN水平均顯著降低（P＜0.05和P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清肌酸激酶、肌酐和尿素氮水平測定結果（s，n為5～8）

表2 各組小鼠血清肌酸激酶、肌酐和尿素氮水平測定結果（s，n為5～8）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，與C組比較；＆P＜0.05，＆＆P＜0.01，＆＆＆P＜0.001，與 M1組比較；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，與 M2組比較；＾P＜0.05，＾＾P＜0.01，與前一批處理比較。

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3.3 組織蛋白含量及MDA含量

前三批處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M2組、M1（21天）組、M2＋F（21天）組的腎組織蛋白含量均顯著升高（P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05），M2＋G組的腎組織蛋白含顯著降低（P＜0.01）；與 M2組相比，M2＋G組的腎組織蛋白含量顯著降低（P＜0.001），M2＋F（17天）組無明顯變化；與 M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組無明顯變化；與M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組無明顯變化。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組的腎組織蛋白含量顯著降低（P＜0.05），M1＋F（35天）組無明顯變化；與前一批次相比，M1（35天）組的腎組織蛋白含量顯著降低（P＜0.01），M1＋F（35天）組無明顯變化。

實驗17天處理的小鼠中，與 M2組相比，M2＋F（17天）組小鼠腎組織蛋白中的 MDA水平顯著降低（P＜0.05），M2＋G組無明顯差異，略有上升。實驗21天處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M1（21天）組和 M1＋F（21天）組腎組織蛋白中的 MDA水平顯著降低（P＜0.05和P＜0.05），M2＋F（21天）組腎組織蛋白中的 MDA水平無明顯變化，有下降趨勢；與 M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組無明顯變化；與 M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組無明顯變化。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組與M1＋F（35天）組的腎組織蛋白中的 MDA水平均顯著降低（P＜0.01和P＜0.001）；與 M1（35天）組，M1＋F（35天）組的腎組織蛋白中的MDA水平顯著降低（P＜0.01）；與前一批次相比，M1（35天）組和 M1＋F（35天）組均顯著降低（P＜0.001和P＜0.001）。

前三批處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M1＋G組、M2組、M2＋F（17天）組、M2＋G組、M1（21天）組、M1＋F（21天）組、M2＋F（21天）組的肝組織蛋白含量均顯著升高（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.001、P＜0.01、P＜0.001和P＜0.01）；與 M2組相比，M2＋G組的肝組織蛋白含量顯著升高（P＜0.01），M2＋F（17天）組無明顯變化；與M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組無明顯變化；與 M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組無明顯變化。實驗35天處理的小鼠中，與C（35天）組相比，M1（35天）組的肝組織蛋白含量顯著升高（P＜0.05），M1＋F（35天）組無明顯變化；與前一批次相比，M1＋F（35天）組的腎組織蛋白含量顯著降低（P＜0.05），M1（35天）組無明顯變化，有降低的趨勢。

前三批處理的小鼠中，與C（21天）組相比，M2＋G組和M1（21天）組的肝組織蛋白中的MDA水平均顯著升高（P＜0.05和P＜0.05），M1＋G組、M2組、M2＋F（17天）組、M1＋F（21天）組和 M2＋F（21天）組無明顯變化，有升高趨勢；與M2組相比，M2＋G組和 M2＋F（17天）組的肝組織蛋白中的 MDA水平無明顯變化；與 M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組無明顯變化；與M2＋F（17天）組相比，M2＋F（21天）組無明顯變化。實驗35天處理的小鼠中，與前一批次相比，M1＋F（35天）組的肝組織蛋白中的 MDA水平顯著降低（P＜0.05），M1（35天）組無明顯變化，有降低趨勢。見表3。

4 討論

臨床中嚴重肌肉疼痛和橫紋肌溶解的主要特征之一為血清肌酸激酶（CK）水平升高［5］，故本實驗以血清中CK值作為造模成功與否的主要指標。與C組相比，低劑量模型組（M1組）跟高劑量模型組（M2組）的血清CK值均顯著升高，說明該橫紋肌溶解模型造模成功。第二批處理的動物結果顯示，與M2組小鼠相比，M2＋附子組的小鼠血清CK值顯著降低，而M2＋關木通組的小鼠血清CK值有升高趨勢。這提示性熱的附子可能對該模型有保護作用，而性寒的關木通則可能會加重該模型的損傷程度。實驗17天及35天處理的動物結果均顯示，與M1組相比，M1＋附子組的小鼠血清CK值均降低。這進一步說明了附子對于該模型具有保護作用。

血清Cr及BUN水平與腎功能的損傷程度成正相關。與M1（21天）組相比，M1＋F（21天）組的Cr水平顯著降低，M2＋F（17天）組及M1＋F（35天）組與相應的模型組相比Cr水平也有降低的趨勢，說明附子對該模型具有一定的保護作用。BUN水平方面，M1＋F組、M2＋F組與相對應的模型組相比沒有明顯的改善。MDA是細胞膜脂質發生過氧化反應的產物，可用于反映細胞的氧化還原狀態。實驗21天處理的小鼠中，M1（21天）組及M1＋F（21天）組的MDA水平均低于C（21天）組，提示組織中與氧化還原相關的酶處于低活性狀態，而M1＋F（21天）組的MDA水平高于M1（21天）組，說明附子可能通過改善腎臟中與氧化還原相關的酶的活性而起到一定的保護作用；實驗35天處理的小鼠中腎組織MDA水平的情況為M1＋F（35天）組＜M1（35天）組＜C（35天）組，給藥時間延長后，附子對模型的保護作用不再顯現出來。實驗21天處理的小鼠中肝組織MDA水平的情況為C（21天）組＜M1（21天）組＜M1＋F（21天）組，而實驗35天處理的小鼠中肝組織MDA水平的情況為M1＋F（35天）組＜M1（35天）組＜C（35天）組。M1（21天）組與 M1（35天）組、M1＋F（21天）組與 M1＋F（35天）組相比，前后者給藥劑量相同，只是實驗時間前者為21天，后者為35天，肝組織內就由膜脂質過氧化反應增加的狀態變成與氧化還原相關的酶處于抑制的狀態，血清中Cr與BUN水平也發生了顯著變化。并且，C（21天）組與C（35天）組比較，肝腎MDA、BUN水平無明顯變化。因此，我們推斷該模型對動物造成的損傷程度與給藥時間的長短有很大關系，附子對于該橫紋肌溶解模型具有保護作用，但也與給藥時間的長短有關，實驗前21天內附子對該模型的保護作用最為顯著，具體的機制需要通過進一步實驗進行探索。

表3 肝、腎組織蛋白及MDA水平測定結果（s，n為5～8）

表3 肝、腎組織蛋白及MDA水平測定結果（s，n為5～8）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，與C組比較；＆P＜0.05，＆＆P＜0.01，＆＆＆P＜0.001，與 M1組比較；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001，與 M2組比較；＾P＜0.05，＾＾P＜0.01，＾＾＾P＜0.001，與前一批處理比較。

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M1＋G組小鼠在第8天開始給造模藥后大批量死亡，故在實驗的第14天予以處理，M2＋G組的也因為同樣的原因在第17天予以處理。以上兩組均是在造模藥的基礎上加給予中藥關木通，這兩組的大批量死亡可能與小鼠肝腎均受到損傷有關。上文已提到性寒的關木通可能會加重該模型的損傷程度。另兩個與腎功能的損傷程度成正相關的生化指標血清Cr及BUN水平顯示，與M2組相比，M2＋G組小鼠的血清Cr及BUN水平均顯著升高，左腎系數顯著增加，腎蛋白含量降低，肉眼觀察發現腎上有若干小血點，表明腎功能受損，導致內生Cr清除率下降，Cr排出減少，同時蛋白質分解代謝增加，從而使BUN升高，進一步提示性寒的關木通可能會加重該模型的損傷程度；M1＋G組由于與相對應的M1模型組給予造模藥時間長短差太多而不好進行比較，但該組的BUN水平與M2＋G組小鼠相當，提示該組小鼠的腎臟也可能受到了一定的損傷。M2＋G組小鼠的肝蛋白含量與C組及M2組相比均顯著升高，肝蛋白中的MDA水平高于M2組，肉眼觀察到肝臟也有損傷，提示M2＋G組小鼠的肝也可能有一定的損傷。

他汀類藥物出現肌病不良反應與其抑制脂類的生物合成及代謝過程有關。附子為溫里藥代表，其藥味辛甘，性大熱，歸心、腎、脾經，走而不守，通行十二經絡；功效回陽救逆，補火助陽，散寒止痛，被稱為“回陽救逆第一品藥”，具有非常重要的臨床價值。我們初步推測附子對本實驗所造的模型的保護作用可能與其性大熱，能提高細胞抗氧化能力有關［6］。

本研究探索附子及關木通對他汀類藥物及貝特類藥物合用所致的橫紋肌溶解模型的影響。結果顯示，該模型對動物造成的損傷程度與給藥時間長短有關，附子對這個模型能起到一定的保護作用，但與給藥時間長短有一定關系，實驗中附子（劑量為3g／kg）在實驗前21天內對該模型的保護作用最為顯著。而在造模的基礎上加給關木通，會加重小鼠的肝腎方面的損傷。這兩味藥性相反的中藥對該模型產生的影響有差異，相關的作用機制需進一步探究。

［1］PIENOR S，M P DIDONNA.Effects of chronic treatment with statins and fenofibrate on rat skeletal muscle：a biochemical，histological and electrophysiological study［J］.Br J Pharmacol，2008，149（7）：909－919.

［2］THOMPSON P D，P.Clarkson，R H Karas.Statin－associated myopathy［J］.JAMA，2003，289（13）：1681－90.

［3］梁茂本.他汀類藥物不良反應87例文獻分析［J］.中國生化藥物雜志，2009，30（5）：336－338.

［4］Molokhia M，P McKeigue.Statin induced myopathy and myalgia：time trend analysis and comparison of risk associated with statin class from 1991－2006［J］.PLoS One，2008，3（6）：e2522.

［5］BAKER SK，TARNOPOLSKY MA.Statin myopathies：pathophysiologic and clinical perspectives［J］.Clin Invest Med，2001，24，258－272.

［6］張濤，王桂杰，白書閣.附子對老年大鼠抗氧化系統影響的實驗研究［J］.中國老年學雜志，2001，3（20）：135－136.