對(duì)苦杏仁燀炒炮制意義的商榷

陳俊怡，賈天柱，2＊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600；2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連116600）

苦杏仁為薔薇科植物山杏（Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.）、西伯利亞杏（Prunus Sibirica L.）、東北杏（Prunus mandshurica Koehne）、杏（Prunus armeniaca L.）的干燥成熟種子［1］，具有降氣止咳、平喘、潤(rùn)腸通便的作用。苦杏仁炮制方法歷史悠久，初見(jiàn)于漢代《金匱要略》去皮尖炒；《雷公炮炙論》有“沸湯浸少時(shí)去皮膜”，此應(yīng)為燀法的開(kāi)始。《外臺(tái)秘要》有“麩炒”等記載［2］。《中國(guó)藥典》從1963年版開(kāi)始收載苦杏仁的燀法炮制，到1977年版只收生苦杏仁，從1985年版至2010版藥典一部苦杏仁的炮制均為燀苦杏仁和燀炒苦杏仁。苦杏仁主要成分為脂肪油和苦杏仁苷，在適宜條件下，如水浸、受潮等條件下，苦杏仁苷會(huì)被共存的苦杏仁苷酶水解，產(chǎn)生氫氰酸，大量氫氰酸可麻痹呼吸導(dǎo)致中毒，甚至死亡，所以苦杏仁不能過(guò)量使用。臨床應(yīng)用時(shí)，苦杏仁必須炮制，以達(dá)到殺酶保苷的目的［3］。其炮制方法有干熱法和濕熱法，如炒法、燀法、燀炒法、蒸法等。所有炮制方法都以最大限度地破壞酶的活性、最大限度地保留苦杏仁苷的含量為考察指標(biāo)。無(wú)論哪一種炮制方法，只要是加熱，都能很好地達(dá)到殺酶保苷的作用。燀后再炒，多帶有焦斑，使白苦杏仁變得黑黢黢，不但表觀難看，還會(huì)造成能源、資源的浪費(fèi)。但也有人認(rèn)為苦杏仁燀后再炒能更好地殺酶，并降低毒性。那么燀后再炒的實(shí)際炮制效果到底如何，殺酶保苷作用能否更強(qiáng)，以及能否明顯降低其毒性，我們對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

鐵研船；島津LC－10Tvp高效液相色譜儀、SPD－10AVP紫外檢測(cè)器（日本島津）、N2000色譜工作站；KQ－250型超聲清洗器（昆山市儀器有限公司）；Sarto－rius Dp225D型電子天平；101型恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；微波爐（格蘭仕 G80F20CN2L－B8）；LXJ－84－01型離心機(jī)（北京醫(yī)療儀器修理廠）；注射器，灌胃針。

1.2 試劑

苦味酸鈉試紙，氫氧化鈉溶液，硫酸亞鐵溶液，稀鹽酸，三氯化鐵試液。分析純甲醇，色譜純甲醇，磷酸（天津科密歐試劑開(kāi)發(fā)中心）。苦杏仁苷對(duì)照品購(gòu)自上海源葉生物有限公司，經(jīng)HPLC法測(cè)定純度＞98.5%。藥材：苦杏仁購(gòu)于安國(guó)藥材市場(chǎng)，對(duì)照藥典由性狀和苦杏仁苷含量鑒定為薔薇科植物杏（Prunus armeniaca L.）的干燥成熟種子。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠（18～22g）購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCKK（遼）2008－0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備

生苦杏仁：取原藥材，除去雜質(zhì)、殘留的核殼及褐色油粒；炒苦杏仁：取凈苦杏仁50g，投入以溫度計(jì)測(cè)量鍋底溫度為130℃～140℃的鐵鍋內(nèi)，炒7min至有爆鳴聲，除去種皮表面呈微黃色，斷面淡黃色，有香氣時(shí)，取出放涼。燀苦杏仁：取凈苦杏仁50g，置500mL沸水中，加熱煮約5min，至膨脹，種皮易脫落時(shí)，撈出，置冷水稍浸，立即取出，搓去種皮，干燥，篩去種皮［4］。燀炒苦杏仁：取干燥的燀苦杏仁50g，置鍋內(nèi)，125℃～135℃炒約5min至表面微黃色，有香氣時(shí)，取出放涼。蒸苦杏仁：取凈苦杏仁50g，置蒸鍋內(nèi)，厚度掌握在2cm以下，流通蒸汽加熱45min，取出，去皮，干燥。以上炮制品均平行制備3份。

2.2 苦杏仁酶活性檢驗(yàn)

苦味酸鈉試驗(yàn)：分別取以上5種炮制品，粉碎（粉末過(guò)2號(hào)篩），取0.5g，置試管中，加水?dāng)?shù)滴使之濕潤(rùn)，在試管口懸掛一條苦味酸鈉試紙，管口用軟木塞塞緊，將試管置40℃～50℃水浴中加熱，數(shù)分鐘后，若樣品中仍殘留苦杏仁苷酶，則苦杏仁苷水解釋放出氧氰酸，與苦味酸鈉作用，使試紙由橙黃色變成磚紅色。普魯士藍(lán)試驗(yàn)：分別取以上6種炮制品，粉碎（粉末過(guò)2號(hào)篩），取0.8g，置試管中，加水濕潤(rùn)，立即用氫氧化鈉溶液濕潤(rùn)的試紙將管口包緊，置40℃～50℃水浴中加熱，在濾紙上加硫酸亞鐵溶液1滴、稀鹽酸1滴、三氯化鐵試液1滴，觀察30min內(nèi)濾紙是否顯藍(lán)色。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各炮制品苦杏仁酶活性檢驗(yàn)結(jié)果

苦味酸鈉試驗(yàn)和普魯士藍(lán)試驗(yàn)均是定性鑒別苦杏仁苷酶解產(chǎn)生的氫氰酸，變色時(shí)間的長(zhǎng)短和變色程度反應(yīng)了氫氰酸的釋放速度和釋放量。氫氰酸的釋放速度和釋放量與酶的含量正相關(guān)。定性鑒別結(jié)果顯示，生品中酶的活性最強(qiáng)，最先變色；而在優(yōu)選條件下的各炮制品，均能將苦杏仁酶較完全滅活。

2.3 苦杏仁各炮制品苦杏仁苷含量比較

HPLC色譜條件：色譜柱為agilentCT－18（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈－1%磷酸水溶液（20∶80），流速為1.0mL／min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；進(jìn)樣體積為10μL。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品24.01mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度。再分別吸取0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度。分別吸取上述6份對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，分析測(cè)定峰面積。以各樣品的濃度（X，mg／mL）對(duì)峰面積（Y，mAu）進(jìn)行線性回歸，得回歸方Y(jié)＝7465479X－126436，r＝0.9997，線性范圍0.048～0.36mg／mL，線性關(guān)系良好。

2.3.2 供試品溶液的制備

分別取以上5種炮制品，粉碎（粉末過(guò)2號(hào)篩），精密稱定約0.25g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇40mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇不足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，同上色譜條件測(cè)得苦杏仁苷峰面積RSD＝1.2%，表明精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10h時(shí)進(jìn)樣，同上色譜條件測(cè)得苦杏仁苷峰面積RSD＝1.2%，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次藥材，按“2.1”和“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液分別進(jìn)樣，同上色譜條件測(cè)得苦杏仁苷峰面積RSD＝1.7%，結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性良好。加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取6份已測(cè)知含量的供試品各約0.5g，每份添加苦杏仁苷對(duì)照品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備并分別進(jìn)樣，同上色譜條件測(cè)得苦杏仁苷平均回收率為99.3%，RSD＝1.9%，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確率高。

2.3.4 含量測(cè)定

抽取各供試品溶液10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算苦杏仁苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各炮制品苦杏仁苷百分含量

2.4 炮制方法對(duì)苦杏仁儲(chǔ)藏的影響比較

在各炮制品密封儲(chǔ)存60天后再次按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備并分別注入液相色譜儀，測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 儲(chǔ)存后各炮制品苦杏仁苷百分含量

2.5 急性毒性比較

2.5.1 供試品制備［6］

分別取上述5種炮制品粗粉（過(guò)二號(hào)篩）各50g，分別精密稱定，備用。量取500mL水置鍋內(nèi)加熱至沸，加入苦杏仁粗粉，迅速加熱至沸，保持微沸，煎煮提取30min，稍冷后3層紗布濾過(guò)，各藥渣再加水400mL，同上煎煮提取30min，稍冷后3層紗布濾過(guò)，輕輕擠壓濾布，使濾液濾盡，合并濾液，減壓濃縮至約20mL，濃縮液3 000r／min離心15min，傾盡上清液，移入25mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為急性毒性用藥（每1mL相當(dāng)于苦杏仁炮制品2g）。

2.5.2 急性毒性試驗(yàn)方法

預(yù)試驗(yàn)給予小鼠生苦杏仁后下水煎液，灌胃前禁食不禁水12h，3只小鼠全死的劑量為48g／kg，3只全不死的劑量8g／kg。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果以35g／kg為最大給藥量，0.7為稀釋系數(shù)，分為三個(gè)劑量組，每組小鼠雌雄各6只，體重18～22g，每只小鼠0.02mL／g，給藥后觀察7天，記錄其中毒狀況及死亡率。以生苦杏仁給藥量作為參考，給予小鼠炒苦杏仁、燀苦杏仁、燀炒苦杏仁、蒸苦杏仁溶液，以35g／kg為最大給藥劑量，以0.7為稀釋等級(jí)系數(shù)，給藥方法、觀察指標(biāo)同生苦杏仁水煎液。

2.5.3 結(jié)果

小鼠給藥后出現(xiàn)少動(dòng)、呼吸急促等癥狀，1h左右出現(xiàn)震顫，臥而不動(dòng)，約4h出現(xiàn)呼吸極弱，最后抽搐掙扎而死亡。多數(shù)死亡小鼠中毒癥狀及時(shí)間相似，死亡小鼠解剖各組織均無(wú)明顯病理改變。急性毒性LD50和95%的可信度區(qū)間利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS根據(jù)Bliss法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。組間LD50兩兩比較，燀苦杏仁與燀炒苦杏仁組t檢驗(yàn)（P＜0.01），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示燀苦杏仁和燀炒苦杏仁組急性毒性無(wú)明顯區(qū)別。

表4 各炮制品急性毒性LD50和95%的可信度區(qū)

3 討論

本文“2.1”采用的各炮制方法，均經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)和實(shí)際試驗(yàn)探索，根據(jù)對(duì)酶的滅活與有效成分含量的保留優(yōu)選工藝參數(shù)所得到的。由于本文主要研究苦杏仁炮制中燀后炒的意義，其優(yōu)選過(guò)程不再列出。在前期的文獻(xiàn)查閱中，有報(bào)道［7］說(shuō)燀苦杏仁在較長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存后，苦杏仁苷含量會(huì)有明顯下降，而燀炒品則不會(huì)。因此進(jìn)行了炮制方法對(duì)苦杏仁儲(chǔ)藏的影響研究。結(jié)果證明，采用優(yōu)選的工藝參數(shù)分別炮制的燀品與燀炒品，在干燥通風(fēng)處儲(chǔ)存60天后，燀品苦杏仁苷含量的下降程度僅略大于燀炒品。這是燀炒品重復(fù)加熱，酶破壞徹底所致，但無(wú)顯著差異，而且其它炮制品如果嚴(yán)格掌握炮制溫度和時(shí)間的話也完全可以達(dá)到。

通過(guò)急性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各炮制品急性毒性與供試液中苦杏仁苷含量呈正相關(guān)。炒苦杏仁、燀苦杏仁、燀炒苦杏仁的苦杏仁苷含量差異較小，其對(duì)小鼠的半數(shù)致死量LD50也沒(méi)有顯著性差異。燀炒品毒性與其他炮制品比較，毒性略低，但也不顯著。其降低原因顯然是因?yàn)橹貜?fù)加熱使苦杏仁苷降低所致。苦杏仁中是否還有除苦杏仁苷外的毒性物質(zhì)，還有待進(jìn)一步研究。

苦杏仁炮制的主要目的就是殺酶保苷，在殺酶的同時(shí)，最大程度地保留苦杏仁苷。無(wú)論用干熱法還是用濕熱法，均可達(dá)此目的。根據(jù)研究結(jié)果，燀炒苦杏仁使苦杏仁苷降低較多，工藝較繁瑣，造成資源和能源上的浪費(fèi)，且外形不美觀，因此建議炮制苦杏仁不采用燀炒法。

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