法舒地爾對家兔脊髓缺血再灌注損傷的影響

周青珍 閻平建 韓 琦 王 崢 佟德華 胡 博

脊髓損傷作為嚴重的神經系統疾病往往導致肢體截癱、肢體感覺及括約肌功能障礙等，嚴重影響患者生活質量，甚至導致呼吸肌麻痹而危及生命，給個人、家庭及社會帶來極大的痛苦與沉重的負擔。過度的炎性反應是脊髓損傷的重要環節，法舒地爾是Rho激酶特異性抑制劑，具有明顯的抗腦缺血及再灌注損傷作用［1～4］，但很少有脊髓缺血再灌注損傷方面的報道。本實驗在成功建立脊髓缺血再灌注損傷模型基礎上，探討法舒地爾對ICAM－1表達水平的影響及對脊髓缺血及再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 普通級日本大耳兔42只，雌雄不限，體重2～2.5 kg，由武漢生物制品研究所提供。

1.1.2 試劑與儀器 法舒地爾購自天津紅日藥業股份有限公司；細胞間粘附分子－1（ICAM－1）多克隆抗體購自美國Molecular Tag分子標記公司；免疫組化二抗染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購自美國ZYMED 公司；肌電圖機購自丹麥維迪公司，型號：KEYTOINT。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型制備

42只家兔隨機分為3組，即假手術組（n＝6）、模型組（n＝18）、法舒地爾組（n＝18），對模型組及法舒地爾組采用腹主動脈夾閉法［5］制作脊髓缺血再灌注模型：無菌條件下，采用仰臥位腹部正中切口，手術分離家兔腹主動脈，在左腎動脈分支起始部下方用動脈夾夾閉腹主動脈，45 min后取下動脈夾實現再灌注。根據再灌注時間又分為再灌注后3 d，7 d，14 d三個亞組（n＝6）；法舒地爾組術后每日腹腔注射法舒地爾10 mg／kg，模型組注射等量生理鹽水，假手術組不予干預。于相應時間點處死家兔，取損傷脊髓，固定備用。假手術組3 d時麻醉處死取脊髓標本。

1.2.2 神經功能評分 術后立即對家兔按照Jacobs法［6］行后肢運動功能評級，具體標準為0 級：全癱（針刺無反應）；1級：嚴重癱瘓，最小功能性運動（肌肉搐動）；2級：能進行功能性運動（受累肢體可負重），但不能齊足跳動，而有共濟失調和輕癱（跛行）；3級：能齊足跳動，但有共濟失調和輕癱；4級：齊足跳動、輕度共濟失調和（或）輕癱（奔跑但不夠靈活）；5級：正常。實驗前后運用肌電圖分別對家兔進行后肢運動誘發電位（motor evoked potential MEP）潛伏期（P1）檢測，記錄電極安放在顱骨正中矢狀線旁開4.0mm，冠狀線下2.5 mm，刺激電極插入腓腸肌，刺激強度5 mA，頻率4 Hz，波寬1.0ms的單方波。

1.2.3 ICAM－1免疫組化染色 家兔缺血45 min再灌注3 d，7 d及14 d時，評級及檢測肌電圖后麻醉并處死家兔，取損傷L1－L5 脊髓，固定，石蠟包埋，制備5μm 厚連續切片，按免疫組化ABC 步驟進行。每張切片隨機采集5個400倍視野輸入圖像分析系統，觀察ICAM－1陽性表達水平。

1.2.4 統計學處理

2 結 果

2.1 對脊髓缺血再灌注家兔神經缺失的影響

脊髓缺血灌注損傷后模型組家兔Jacobs評分與假手術組相比明顯降低（P＜0.001），7 d亞組神經功能缺損最重；法舒地爾組家兔Jacobs評分與模型組相比明顯升高（P＜0.01），而3 d、7 d、14 d三個亞組之間Jacobs評分相比差異明顯（P＜0.05）（見表1）。

表1 各組家兔后肢Jacobs評分的影響（±s，n＝6，分）

表1 各組家兔后肢Jacobs評分的影響（±s，n＝6，分）

組別 Jacobs評分3 d 7 d 14d假手術組 5.00±0.00模型組 1.50±0.55 1.17±0.75 1.50±0.54法舒地爾組 2.00±0.63 2.17±0.75 2.67±1.03

2.2 對后肢運動誘發電位的影響

治療后模型組及法舒地爾組運動誘發電位潛伏期P1較治療前明顯縮短（P＜0.001），（表2）。

表2 法舒地爾對運動誘發電位的影響（±s，n＝18，s）

表2 法舒地爾對運動誘發電位的影響（±s，n＝18，s）

組別 潛伏期P1治療前 治療后模型組 39.28±4.19 52.92±3.01法舒地爾組 38.22±5.50 44.74±5.16

2.3 對脊髓ICAM－1表達水平的影響

ICAM－1蛋白陽性染色為棕黃色，主要分布在微血管和毛細血管的內皮細胞。假手術組家兔脊髓血管內皮僅有微量的ICAM－1表達，模型組脊髓血管內皮ICAM－1表達明顯增強，陽性血管數明顯增多（P＜0.01），以7 d時表達最明顯；與模型組相比，法舒地爾組脊髓ICAM－1表達相對減弱，陽性血管數相對減少（P＜0.01）（圖1～3、表3）。

圖1 假手術組（×400）

圖2 模型組（×400）

圖3 法舒地爾組（×400）

3 討 論

脊髓缺血再灌注損傷后，與再灌注有關的急性炎癥反應在繼發性脊髓損傷中的作用日益受到重視［7］，細胞粘附分子是近年來發現的一類細胞表面的糖蛋白，參與正常組織形態和結構的維持，影響內皮細胞之間的連接以及細胞－基底膜之間的粘附，保證內皮細胞層的連續性通透屏障功能［8，9］。在機體免疫、炎癥反應中粘附分子介導了白細胞的粘附和活化。血管內皮細胞表面的粘附分子包括ICAM－1，ICAM－2等，它們的表達與白細胞粘附到血管壁以及穿越內皮細胞現象有關。其中ICAM－1為比較重要的粘附分子，作為白細胞表面粘附分子CD11／CD18系統的配體，炎癥時內皮細胞ICAM－1 表達量的升高介導了白細胞的活化及其與血管壁的緊密粘附，為白細胞進一步跨內皮游出提供了條件。正常情況下ICAM－1僅在脊髓微血管內皮細胞及星形膠質細胞低表達，但在一些炎癥遞質刺激下它們在血管內皮細胞的表達明顯升高。本實驗研究發現，在家兔脊髓缺血再灌注3 d時ICAM－1表達明顯升高，在7 d時達高峰，在14 d時仍有較高水平表達。與此相符，神經功能缺損程度3 d時明顯加重，7 d時達高峰，14 d 時仍有部分功能障礙。這說明ICAM－1的遲發表達增多，促進白細胞和血管內皮細胞的粘附、脊髓微循環障礙及血脊髓屏障通透性增加，加重脊髓損傷后缺血、水腫、炎癥病理過程。

法舒地爾是Rho激酶特異性抑制劑，能夠擴張動脈血管，拮抗細胞內鈣離子抑制肌動－肌球蛋白的相互作用，可有效降低炎性細胞分泌炎性因子（IFN－γ、IFN－α、IL－8、IL－1β），并可抑制炎性細胞粘附和浸潤。此外，Rho 激酶抑制劑還可通過抑制caspase－3而抑制神經元凋亡，甚至可以增加內源性神經干細胞分化增殖［10］。本實驗也證實，經法舒地爾治療后ICAM－1表達明顯減少，后肢Jacobs評分較模型組明顯減輕，運動誘發電位潛伏期P1明顯縮短，隨時間延長，治療組各亞組之間神經功能缺損情況及ICAM－1表達有統計學意義，提示早期、足療程應用法舒地爾治療可減少炎癥反應，最終減輕神經功能損害。法舒地爾對脊髓神經功能的保護作用機制可能為（1）法舒地爾能增加eNOS的表達，舒張血管增加局部血流量，延緩缺血組織進入不可逆的細胞死亡過程；（2）法舒地爾對缺血區神經元有直接的保護作用；（3）法舒地爾可以改善缺血區的微循環功能；（4）法舒地爾可以抑制缺血區白細胞的滲出，減輕炎癥反應對神經組織造成的損傷。但是，經治療家兔脊髓缺血／再灌注損傷14 d后仍有部分神經功能缺損，這說明脊髓缺血／再灌注后炎性反應僅是導致神經損傷的一種原因，仍有其他因素參與，有待進一步研究。

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