血漿NO 在阿爾茨海默病患者中的表達(dá)及意義

彭 譽(yù) 周 華 邱晨紅 孫沁怡 王 鋒 謝紅娜 趙 中

影響阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）臨床診斷的因素較多，難度較大，特別是早期診斷，目前臨床上對AD 的主要診斷依靠臨床癥狀、神經(jīng)影像學(xué)及神經(jīng)心理學(xué)。2011年4 月發(fā)布的AD 最新診斷標(biāo)準(zhǔn)即NIA－AA 診斷標(biāo)準(zhǔn)［1～3］將腦脊液生物標(biāo)記物納入AD 診斷中。腰穿為有創(chuàng)檢查，對于有認(rèn)知功能下降的患者依從性較差，故AD 患者血漿生物學(xué)指標(biāo)尋找是目前研究的重點(diǎn)。一氧化氮（nitric oxide，NO）是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的信號分子，當(dāng)其水平較高時可導(dǎo)致線粒體功能障礙、凋亡通路的激活等，介導(dǎo)神經(jīng)毒性，參與與AD 發(fā)病相關(guān)的β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積、tau蛋白異常磷酸化等特征性病理改變［4～6］。本研究旨在探討血漿NO 在AD 患者中的表達(dá)及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 于2011年1月－2012年3月入住本院神經(jīng)內(nèi)科治療的AD 患者中抽取48例為研究對象，其中男23例（47.9%），女25例（52.1%），年齡61～83歲，平均年齡（69.32±5.53）歲，文化程度為文盲10 例（20.8%），小 學(xué)16 例（33.3%），中學(xué)、中專14例（29.2%），大學(xué)及以上8例（19.7%），MMSE評分（13.9±2.3）分，病程3～10年，平均病程（4.20±1.21）年。AD 診斷均符合美國精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊第4版（Diagnostic Statistical Manual 4 th edition，DSM—IV）中AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)，簡易精神狀態(tài)檢查量表（Mini.Mental State Examination，MMSE）評分＜24 分，哈金斯基缺血指數(shù)（HIs）評分（2.4±0.6）分，日常生活量表（ADL）評分（29.1±3.4）分，臨床癡呆量表（CDR）評分（1.5±0.6）分，總體衰退量表（GDS）評分為三級以上，并根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、精神檢查、頭部CT 和MRI檢查以及其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查排除其他系統(tǒng)疾病和有毒物質(zhì)等所引起的癡呆。

取同期在本科治療的VD 患者41例以及同期體檢無認(rèn)知功能障礙老年人37 例為對照組。VD組男25 例（61.0%），女16 例（39.0%），年齡64～87歲，平均年齡（75.95±8.42）歲，文化程度為文盲9例（22.0%），小學(xué)13 例（31.7%），中學(xué)、中專12例（29.3%），大學(xué)及以上7 例（17.0%），MMSE 評分（18.3±1.9）分，病程2～8年，平均病程（4.52±0.93）年，所有患者均符合DSM.IV 中血管性癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)，蒙特利爾認(rèn)知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）評分＜26 分，ADL評分（19±0.6）分，CDR 評分（0.6±0.1）分，GDS評分為二、三級，病史、臨床表現(xiàn)、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、精神檢查、頭部CT 或MRI檢查均提示存在腦血管病和局灶性神經(jīng)系統(tǒng)體征。NC 組37例，其中男19 例（51.4%），女18例（48.6%），年齡62～83歲，平均年齡（71.06±5.87）歲，文化程度為文盲8 例（20.9%），小學(xué)11例（30.0%），中 學(xué)、中專11例（30.0%），大學(xué)及以上7 例（19.1%），MMSE 評分＞24分，MoCA＞26分，無精神疾病史和精神病家族史，平時體健，近期體檢正常。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本的采集及NO 水平的測定

清晨抽取空腹靜脈血2 ml，肝素抗凝，1 500 r／min離心10 min，完全分離血漿，保存于－80℃冰箱待測。采用兔抗人NO ELISA 試劑盒（美國AdlitteramDiagnostic Laboratories）檢測血漿NO水平，檢測步驟嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.2 神經(jīng)心理學(xué)量表檢查

使用國內(nèi)外公認(rèn)的癡呆初篩量表MMSE評定。MMSE共分11項(xiàng)，包括時間定向、地點(diǎn)定向、即刻記憶、注意和計(jì)算、近記憶檢查、物體命名、語言復(fù)述、語言理解、閱讀理解、句子書寫以及圖形描畫等11項(xiàng)內(nèi)容，共計(jì)30 分。劃分癡呆標(biāo)準(zhǔn)：文盲≤17分，小學(xué)≤20分，中學(xué)≤22分，大學(xué)≤23分，凡是達(dá)不到此分值的，均認(rèn)為其有程度不等的認(rèn)知功能損害，即文盲＜18 分，小學(xué)＜21分，初中及以上＜25分，測試時間約10 min。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，定量資料比較采用t檢驗(yàn)，定性資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析和多元線性回歸分析。P＜0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 相關(guān)指標(biāo)水平

AD 組和對照組的年齡和性別構(gòu)成差別均不明顯（P＞0.05）。AD 組和VD 組患者在性別、年齡、受教育年限以及吸煙、糖尿病、高血壓病、高脂血癥、腦卒中史等方面比較無明顯差異（P＞0.05，表1），具有可比性。

表1 AD 組、VD 組患者基本臨床特征

2.2 AD組、VD組、NC組患者血漿NO水平的比較在校正性別、年齡、吸煙、受教育程度以及既往疾病史等變量后AD 組患者血漿NO 水平［41.01±16.40］umol／L 明 顯 高 于NC 組［16.00±6.63］umol／L（P＜0.01）以及VD 組患者血漿NO 水平［21.28±6.71］umol／L（P＜0.01）（表2）。

2.3 AD 患者血漿NO 水平與MMSE 分值的相關(guān)性

對AD 組患者血漿NO 水平和MMSE 評分進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，AD 組患者血漿NO 水平和MMSE得分呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.194，P＜0.01）。從圖1可見，有1例患者（左下角）MMSE 評分和NO水平均較低，明顯偏離直線，考慮為偏離較大的變量值（圖1）。

表2 AD 組、VD 組、NC組血漿NO 水平比較（μmol／L）

圖1 AD 患者血漿NO 水平與MMSE分值的相關(guān)性

2.4 AD 患者NO 水平與各個認(rèn)知領(lǐng)域的相關(guān)性

對AD 患者各個認(rèn)知領(lǐng)域的分值與血NO 水平進(jìn)行多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，血漿NO 水平與患者記憶力、定向力、注意力和計(jì)算能力呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與命名能力、語言流暢能力、視空間執(zhí)行能力和抽象概括能力等無相關(guān)性（表3）。

表3 AD 患者NO 水平與各個認(rèn)知領(lǐng)域評分的回歸分析

3 討 論

No是神經(jīng)系統(tǒng)中的重要信號分子。在AD 的形成過程中NO 水平的增高與學(xué)習(xí)記憶減退密切相關(guān)，如果NO 釋放過量，它在AD 的神經(jīng)毒性作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其保護(hù)作用［4］。實(shí)驗(yàn)表明，AD 模型組大鼠較正常組腦組織NO 水平顯著升高。高水平的NO 是一種神經(jīng)毒害因子，除作為自由基以及與超氧陰離子結(jié)合形成超氧亞硝酸鹽產(chǎn)生直接毒性外，還可使遞質(zhì)釋放異常，產(chǎn)生神經(jīng)元興奮毒性及炎癥性損害，廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷過程［7］。用組織化學(xué)的方法已經(jīng)證實(shí)，神經(jīng)元的損傷可引起大腦皮質(zhì)、海馬等許多腦區(qū)中一氧化氮合酶（NOS）表達(dá)增加［8］。NOS催化分子氧與左旋硝基精氨酸生成NO。NOS表達(dá)增加或活性增加可引起NO 過量生成。過多的NO 可直接影響機(jī)體鐵代謝、能量代謝和蛋白質(zhì)功能，對基因產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，直接參與AD 的病理過程。

本研究結(jié)果顯示，AD 患者NO 水平顯著高于對照組（P＜0.01）和VD 組（P＜0.01），同時也可作為阿爾茨海默病與血管性癡呆鑒別診斷的生物學(xué)指標(biāo)，這與國外文獻(xiàn)報道一致［9，10］，這可能是因?yàn)樽杂苫軐?dǎo)致NOS 增加，進(jìn)而導(dǎo)致血漿NO 水平升高［11］。同時本研究還首次發(fā)現(xiàn)AD 患者NO 水平與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)，即AD 患者血漿NO 水平越高，MMSE分值越低，提示NO 水平的改變可以反映AD 患者認(rèn)知功能損害的程度。推測其機(jī)制可能為：（1）阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體受到感染、疾病或環(huán)境等的影響時機(jī)體氧化水平超過抗氧化水平，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）等高活性的分子就會大量堆積，而高水平的NO 參與β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致AD 的產(chǎn)生［4，12］；（2）研究顯示，AD 患者存在明顯的內(nèi)側(cè)顳葉結(jié)構(gòu)病變，包括海馬結(jié)構(gòu)、杏仁核和海馬旁回，而這些位置的糖代謝效率較高，對氧的需求最高，線粒體氧化磷酸化的同時能產(chǎn)生大量的氧自由基和氮自由基，而上述結(jié)構(gòu)清除自由基和抗氧化能力較差，而這些部位是腦認(rèn)知功能重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其損害程度與認(rèn)知功能下降幅度相關(guān)［13］。當(dāng)各種危險因素導(dǎo)致上述部位損害時，損害愈重，認(rèn)知功能下降愈明顯，NO 水平升高也越顯著。

通過對AD 患者各個認(rèn)知領(lǐng)域的分值與血漿NO 水平進(jìn)行多元線性回歸分析后發(fā)現(xiàn)，這些患者記憶功能、注意力、計(jì)算能力和定向力的損害情況與NO 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，這可能由于AD 患者的記憶功能、注意力、計(jì)算能力和定向力損害較為明顯（14），且呈進(jìn)行性加重，所以與NO 的水平變化趨勢存在相關(guān)性。至于是否存在其他機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

此外，圖1還可以看到有1個觀察點(diǎn)明顯偏離直線，提示這些患者雖認(rèn)知功能損害嚴(yán)重，但NO的水平并未升高，與上述結(jié)論不完全相符，考慮其原因可能為部分患者可能為合并AD 的混合性癡呆，有研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者NO 水平表達(dá)下降［15］，所以對于混合性癡呆患者，NO 水平可能與認(rèn)知功能損害程度不一致。

總之，NO 作為神經(jīng)系統(tǒng)中的重要信號分子，在AD 患者血漿中表達(dá)增加，且與記憶功能、注意力、計(jì)算能力和定向力的損害有關(guān)，可以反映AD 患者的腦損傷程度。血漿NO 水平的測定有可能作為觀察AD 患者認(rèn)知功能損害程度的生化指標(biāo)，同時亦可作為阿爾茨海默病與血管性癡呆鑒別診斷的生物學(xué)指標(biāo)，對于AD 診斷具有重要意義。

1 Sperling RA，Aisen PS，Beckett LA，et al.Toward defi ning the preclinical stages of Alzheimer’s disease：Recommendations from the National Institute on Aging－Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease.Alzheimers Dement，2011，7（3）：280－292.

2 Albert MS，DeKosky ST，Dickson D，et al.The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer's disease：Recommendations from the National Institute on Aging－Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease.Alzheimers Dement，2011，7（3）：270－279.

3 Ch telat G，Villemagne VL，Bourgeat P，et al.Relationship between atrophy and beta－amyloid deposition in Alzheimer disease.Ann Neurol，2010，67（3）：317－324.

4 Luth HJ，Holzer M，Gartner U，et al.Expression of endothelial and inducible NOS－isoforms is increased in Alzheimer's disease，in APP23 transgenic mice and after experimental brain lesion in rat：evidence for an induction by amyloid pathology.Brain Res，2001，913（1）：57－67.

5 Magran J，Rosen KM，Smith RC，et al.Intraneuronal beta－amyloid expression downregulates the Akt survival pathway and blunts the stress response.J Neurosci，2005，25（47）：10960－10969.

6 Medeiros R，Prediger RS，Passos GF，et al.Connecting TNF－alpha signaling pathways to iNOS expression in a mouse model of Alzheimer's disease：relevance for the behavioral and synaptic deficits induced by amyloid beta protein.J Neurosci，2007，27（20）：5394－5404.

7 Malinski T.Nitric oxide and nitroxidative stress in Alzheimer's disease.J Alzheimers Dis，2007，11（2）：207－218.

8 Stepanichev MY，Onufriev MV，Yakovlev AA，et al.Amyloidbeta（25－35）increases activity of neuronal NO－synthase in rat brain.Neurochem Int，2008，52（6）：1114－1124.

9 Vural H，Sirin B，Yilmaz N，et al.The Role of Arginine－Nitric Oxide Pathway in Patients with Alzheimer Disease.Biol Trace Elem Res，2009，129（1－3）：58－64.

10 Sinem FK，Dildar E，G?khan BM，et al.The Serum Protein and Lipid Oxidation Marker Levels in Alzheimer's Disease and Effects of Cholinesterase Inhibitors and Antipsychotic Drugs Therapy.Current Alzheimer Research，2010，7（5）：463－469.

11 Parks J，Smith KTS，Trimmer PA，et al.Neurotoxic Abeta peptides increase oxidative stress in vivo through NMDA－receptor and nitric－oxide－synthase mechanisms，and inhibit complex IV activity and induce a mitochondrial permeability transition in vitro.J Neurochem，2001，76（4）：1050－1056.

12 Sultana R，Perluigi M，Butterfield DA.Oxidatively modified proteins in Alzheimer's disease（AD），mild cognitive impairment and animal models of AD：role of Abeta in pathogenesis.Acta Neuropathol，2009，118（1）：131－150.

13 Jagust S W，Pmitron emission temography and magnetic re9Dllance in 1agingin the diagnosis and prediction of dementia.Alzheimers Dement，2006，2（1）：36－42.

14 Loewenstein DA，Acevedo A，Agron J，et al.Cognitive profiles in Alzheimer's disease and in mild cognitive impairment of different etiologies.Dement Geriatr Cogn Disord，2006，21（5－6）：309－315

15 Corzo L，Zas R，Rodr guez S，et al.Decreased levels of serum nitric oxide in different forms of dementia.Neurosci Lett，2007，420（3）：263－267.