丹皮酚誘導人MCF-7細胞凋亡的機制

王建杰 羅文哲 苗 智 宋漢君 齊建祥 王茉琳 (佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 54007)

丹皮酚誘導人MCF-7細胞凋亡的機制

王建杰 羅文哲 苗 智 宋漢君 齊建祥1王茉琳 (佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 觀察丹皮酚誘導人MCF-7乳腺癌細胞凋亡形態學和凋亡率的機制。方法 應用MTT法觀察丹皮酚對MCF-7細胞的細胞毒作用;應用hoechst單染觀察丹皮酚對腫瘤細胞形態學的影響;Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀測定丹皮酚誘導MCF-7細胞凋亡的凋亡率。結果

丹皮酚作用于MCF-7細胞的IC50為60 mg/L;細胞形態學出現核碎裂、凋亡小體等典型的細胞凋亡特征;60 mg/L丹皮酚作用24 h、48 h的凋亡率分別為14.24%和28.47%。結論 丹皮酚通過誘導MCF-7細胞凋亡而抑制腫瘤細胞生長。

丹皮酚;細胞凋亡;乳腺癌

牡丹皮的有效成分具有解熱鎮痛、抗炎和免疫調節、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用。臨床研究發現，在宮頸癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效治療方劑中均包含有牡丹皮〔1〕。丹皮酚 (Paeonol)是牡丹皮中的主要活性成分。據文獻報道，丹皮酚能抑制某些腫瘤細胞的增殖，如人白血病細胞株(K562)，人肝癌細胞株(Bel-7404)，人宮頸癌細胞株(HeLa)以及人大腸癌細胞株(HT-29)，并能夠增強化療藥物順鉑抗食管癌的作用〔2〕。本課題組應用丹皮酚處理小鼠乳腺癌(EMT6)模型，證實丹皮酚具有抗乳腺癌的作用〔3〕。但對于人的乳腺癌細胞尚沒有相關報道。本研究應用人乳腺癌細胞株MCF-7細胞觀察丹皮酚作用于乳腺癌的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人MCF-7細胞株購于中國醫學科學院腫瘤研究所細胞庫。RPMI 1640培養液購于Gibco公司，胎牛血清來源于Hyclone公司。四甲基偶氮唑藍 (MTT)為北京拜爾迪生物技術公司產品。二甲基亞砜(DMSO)為Sigma Aldrich Inc公司產品。Hoechst購于beyotime公司。Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京KeyGen生物技術有限公司。流式細胞儀，Epics-XLⅡ型，美國Becton Dickinson公司;熒光顯微鏡及照相系統，日本Nikon公司;Multiskan MK3型酶標儀，美國Thermo公司。

1.2 細胞培養

將人MCF-7細胞以適量濃度接種于9 cm細胞培養皿中。加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃，5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁生長，每2～3 d傳代1次。試驗均于細胞處于對數生長期時進行。

1.3 MTT法檢測丹皮酚對MCF-7細胞增殖活性的影響

將處于對數生長期的細胞用胰酶進行消化，調整細胞密度至5 ×104～1 ×105/ml，接種于 96 孔培養板中，每孔 100 μl，培養24 h，加入不同濃度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每個濃度均設4個平行孔，用RPMI1640完全培養液作為陰性對照組，同時設空白調零，放于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養 24 h、48 h 后，每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20 μl，于培養箱中繼續培養4 h后，加入200 μl DMSO溶液，振蕩10 min后酶標儀于492 nm處測OD值，按式計算細胞生長抑制率。

細胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 Hoechst 33342熒光單染觀察細胞形態學

調細胞密度至5×104個/ml，接種于 6孔板中，每孔 3 ml，24 h后，吸棄培養液。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，60 mg/L丹皮酚處理細胞，陰性對照組為RPMI1640完全培養液，繼續培養24 h、48 h后，每孔加入100 μl Hoechst 33342(終濃度 10 μg/ml)，4 ℃ 避光染色15～20 min，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.5 Annexin V-FITC染色檢測MCF-7細胞凋亡

5×104個/ml細胞懸液接種于6孔板，每孔3 ml，24 h后以60 mg/L丹皮酚處理細胞，RPMI1640為對照，24 h、48 h后，胰酶消化，收集細胞，按試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，激發波長488 nm。以CellQuest軟件分析結果。

2 結果

2.1 細胞形態學變化

60 mg/L的丹皮酚處理MCF-7細胞24 h、48 h后，Hoechst熒光染色結果顯示，細胞出現明顯的凋亡形態學改變，細胞變小，細胞核呈碎裂狀態，藍色激發光強于陰性對照組細胞，熒光變得致密，因此核被染成亮藍色，并可見明顯的粒狀熒光體聚集，新月體樣改變，凋亡小體形成等，以48 h后變化更明顯。見圖1。

圖1 丹皮酚對MCF-7細胞形態的影響(×400)

2.2 丹皮酚對細胞增殖活性的影響

丹皮酚處理MCF-7細胞24 h的IC50高于250 mg/L，而丹皮酚處理MCF-7細胞48 h后的IC50約是60 mg/L，說明丹皮酚作用48 h后對MCF-7細胞增殖具有直接抑制作用，并呈劑量依賴性關系。

2.3 Annexin V-FITC染色檢測MCF-7細胞凋亡

以60 mg/L丹皮酚處理MCF-7細胞24、48 h后，丹皮酚能誘導MCF-7細胞出現了明顯的凋亡，60 mg/L丹皮酚24 h、48 h的凋亡百分數分別為14.24%和28.47%，比對照組的凋亡百分數(5.54%)明顯增加。

3 討論

MTT分析是以代謝還原MTT為基礎的方法。在細胞增殖過程中活細胞線粒體脫氫酶可將黃色可溶性MTT分子內環狀結構斷裂形成藍紫色不溶性甲臜，DMSO可以使之溶解，酶標儀則可在一定波長下檢測光密度值;死亡細胞中線粒體脫氫酶消失，無法使MTT還原，因此不能形成藍紫色甲臜，觀察不到顏色變化。MTT法較其他方法如臺盼藍計數法相比具有客觀性強、簡單易行等優點，因此被廣泛用于抗腫瘤藥物的初篩。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡 (PCD)，是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序死亡。通常認為惡性轉化的腫瘤細胞是因為失控生長、過度增殖。從細胞凋亡的角度來看則認為是腫瘤的凋亡機制受到抑制不能正常進行細胞死亡清除的結果。許多化療藥物能夠誘導腫瘤細胞凋亡，如紫杉醇、順鉑、長春新堿等，誘導腫瘤細胞凋亡也成為腫瘤治療的一個重要的策略。目前很多藥物的開發和研制都把誘導細胞凋亡作為藥物療效的一個衡量指標〔4，5〕。

本試驗證明丹皮酚誘導了人MCF-7發生了細胞凋亡。丹皮酚通過誘導MCF-7細胞凋亡而發揮抗乳腺癌作用。

1 Tang B，Jiang J.Study of the CpG methylation status of ER alpha gene in estrogen receptor alpha-negative breast cancer cell lines and the role of hydralazine demethylation〔J〕.Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2005;34(5)：283-7.

2 Mimura K，Baba S.Determination of paeonol metabolites in man by the use of stable isotopes〔J〕.Chem Pharm Bull，1981;18(7)：2043-50.

3 Wang J，Qingwang L，Yetao O，et al.Antitumor effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast infiltrating ductal carcinoma〔J〕.Lat Am J Pharm，2010;29(5)：369-75.

4 Reed JC.Mechanisms of apoptosis〔J〕.Am J Pathol，2000;157(5)：1415-30.

5 Mlejnek P.Caspase inhibition and N6-benzyladenosine-induced apoptosis in HL-60 Cells〔J〕.J Cell Biochem，2001;83(4)：678-89.

R737.9

A

〕 1005-9202(2012)22-4953-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.046

黑龍江省自然科學基金資助(No.D201063);黑龍江省教育廳科研項目(No.12521555)

1 佳木斯大學附屬第二醫院

齊建祥(1963-)，男，主任醫師，主要從事心血管內科臨床治療研究。

王建杰(1968-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中藥抗腫瘤分子機制的研究。

〔2012-03-20收稿 2012-04-10修回〕

(編輯 袁左鳴)