孕烷X受體抗食管癌EC9706細胞凋亡的作用機制

謝晶華 解智慧 史祖宣 樊青霞 (鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科一病區，河南 鄭州 450052)

孕烷X受體抗食管癌EC9706細胞凋亡的作用機制

謝晶華 解智慧 史祖宣 樊青霞 (鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科一病區，河南 鄭州 450052)

目的 研究孕烷X受體(PXR)抗食管癌EC9706細胞凋亡的作用機制。方法 使用利福平活化食管鱗癌 EC9706細胞中的PXR，阿霉素(ADM)誘導高表達PXR的EC9706細胞凋亡，采用流式細胞儀觀察細胞的增殖周期，MTT法觀察細胞凋亡率，Western印跡和免疫組化法檢測Caspase-3，Bcl-2，Bax蛋白表達情況。結果 ADM處理可以明顯抑制細胞生長;使細胞呈明顯凋亡改變;利福平誘導PXR高表達的EC9706細胞凋亡減少，抑制Caspase-3的蛋白水平，上調蛋白Bcl-2的表達，表明PXR在抗食管鱗癌細胞凋亡中發揮重要的作用。結論 PXR可能是通過降低Caspase-3和升高Bcl-2蛋白的表達抑制食管癌細胞EC9706的凋亡。

食管癌;細胞凋亡;孕烷X受體;Caspase-3;Bcl-2

孕烷X受體(PXR)，亦稱為類固醇X受體，其主要生物學功能是參與機體對內源及外源化合物的代謝及排泄過程，是核受體家族重要成員之一。核受體在藥物代謝轉運和藥物之間相互作用中扮演重要角色，尤其是PXR，其配體具有泛宿主性，很多藥物包括抗癌藥物都是其配體。近幾年對PXR的基因定位、基因結構特點、組織分布、作用機制及其與多種腫瘤的關系等研究取得一定進展。本文擬研究PXR在抗食管癌 EC9706細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細胞株EC9706購自中國科學院上海細胞生物學研究所;RPMI1640培養基購自英國DIOMED;胎牛血清(FBS)購自Odyssey公司;胰蛋白酶購自Gibco公司;MTT試劑盒購自美國Sigma公司;羊抗鼠熒光二抗700購自LI-COR Biosciences基因公司;羊抗兔熒光二抗800購自LI-COR Biosciences基因公司;總RNA抽提試劑盒和RT-PCR反應試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司;HRP標記的羊抗鼠的二抗購自Rockland公司;β-actin鼠抗人的單抗購自 Sigma公司;BCA標準蛋白檢測系統購自Pierce公司;蛋白預染Marker購自Fermentas公司。

1.2 MTT法檢測細胞活力

將EC9706細胞分為兩組，一組加0.1%二甲基亞砜(DMSO)作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。預處理24 h后，接種于96孔板，每孔約1×103個細胞，設定3個復孔，兩組均設調零空白對照組(不加細胞，只加相應培養基)，連續培養，繼續分別加入0.1%DMSO、10 μmol/L 利福平進行處理。將 1 μg/ml ADM 分別加入處于對數生長期的細胞培養瓶中，在第1、3、5、7天時，每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h后，小心吸去培養液，加入150 μl DMSO，溶解紫色結晶物，在微孔板振蕩器上震蕩10 min。用Model 550型酶標儀在波長490 nm測吸光度(OD值)，以空白對照組調零。試驗重復3次，取均值。

通過下列公式計算細胞生長抑制率：生長抑制率(%)=(實驗組 OA490值-對照組 OA490值)/對照組OA490值×100%。

1.3 流式細胞儀檢測細胞周期

將對數生長期的EC9706細胞用不含血清的新鮮培養液培養8 h，使細胞停止生長，處于同一細胞周期，然后將細胞制成懸液，調整細胞數為4×104個/ml，各取5 ml細胞懸液培養于75 ml細胞培養瓶，常規培養、消化、離心、收集各用藥組(一組加0.1%DMSO作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組)和陰性對照組培養48 h的EC9706細胞，將1 μg/ml ADM分別加入處于對數生長期的細胞培養瓶中，用冷PBS液洗滌細胞兩次，加入預冷70%的乙醇并均勻吹打，盡量制備成單細胞懸液，4℃冰箱固定24 h，隨后再用冷PBS液洗滌細胞兩次去除固定液，加1 ml碘 化 丙 錠 染 液(含 碘 化 丙 錠 100 μg/ml，RNA 酶100 μg/ml)，混勻，置4℃避光染色30 min，上流式細胞儀，用氬離子激發碘化丙錠產生紅色熒光，記錄激發波長488 nm處紅色熒光，檢測細胞DNA含量。用計算機自帶Multicycle(Phoenix Flow System，San Diego，CA，USA)軟件分析，計算凋亡細胞百分數及細胞周期百分數。

1.4 Western印跡檢測高表達PXR蛋白的EC9706細胞以及野生型 EC9706細胞中 Bcl-2、Caspase-3、B

(1)將EC9706細胞分為兩組：一組加0.1%DMSO作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。將1 μg/ml ADM分別加入處于對數生長期的細胞培養瓶中，作用48 h后，提取細胞核蛋白。約6×106個細胞，加預冷PBS漂洗2次，用細胞刮子快速將細胞刮下，500 r/min×3 min，棄上清，盡可能干燥沉淀，加200 μl細胞質蛋白和細胞核蛋白抽提試劑(CERI)，劇烈漩渦振蕩15 s，充分重懸，冰上10 min。

(2)從不同蛋白樣品中取出等量蛋白(50 μg)與1×SDS凝膠上樣緩沖液混合，加入4%體積的 β-巰基乙醇，煮沸10 min。然后在4℃下，15 000 r/min離心5 min。蛋白上樣，經由10%SDS-PAGE分離膠分離，轉印至PVDF膜上。將此膜取下，剪角后在5%脫脂奶粉封閉液中緩慢搖動2～4 h。然后。將特異性一抗按1∶1 000～1∶2 000稀釋。與膜一起孵育過夜。1×PBST洗滌3次，每次10 min。隨后將此膜與相應的二抗(1∶3 000～1∶4 000)一起孵育4 h。在1×PBST洗滌3次后，利用增強性化學發光試劑盒(ECL)檢測特異性蛋白條帶。由兩位資深科研中心教授獨立觀察每張切片后一起做出判斷。每例切片隨機選擇10個高倍視野(×400)，每個視野計數100個細胞。

參照吳嬋妮等〔2〕的方法如下計算結果：陽性率=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.5 免疫組化法檢測EC9706細胞中的Capase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達

載玻片經泡酸、清洗、高溫滅菌后置于6孔培養板中，取對數生長期細胞胰酶消化成單細胞懸液后，將EC9706細胞分為兩組：一組加0.1%DMSO作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。將1 μg/ml ADM分別加入處于對數生長期的細胞培養瓶中，作用48 h后，以每毫升2×105個細胞濃度接種于6孔培養板中，每孔2.5 ml，培養24 h后棄去培養液，PBS洗滌3次，丙酮固定10 min。室溫下0.5%H2O2-甲醇作用30 min，山羊血清封閉1 h，PBS洗滌后滴加一抗，4℃過夜，PBS洗滌后滴加生物素標記的兔抗鼠二抗工作液，室溫作用30 min，PBS洗滌后滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液作用1 h，PBS洗滌后DAB顯色5 min，蘇木素復染，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 EC9706細胞生長曲線和倍增時間

在液體懸浮培養條件下，EC9706細胞呈單個散在貼壁生長。細胞種植密度為5×104/ml，此濃度細胞從換液后的第24～96小時呈指數增殖，實驗測得EC9706細胞倍增時間為20～24 h(見圖1)。

圖1 食管癌EC9706細胞生長曲線

2.2 利福平活化核受體PXR對食管癌EC9706細胞增殖和化療敏感性的影響

2.2.1 利福平對食管癌EC9706細胞核受體PXR表達的影響

根據以上結果，選擇EC9706細胞作為研究PXR基因功能的對象。EC9706細胞經10 μmol/L利福平處理 48 h后，提取EC9706細胞核蛋白，采用Western印跡方法進一步檢測PXR核蛋白表達水平變化。分子量50 kD位置，與0.1%DMSO處理對照組相比，利福平處理組核蛋白條帶明顯增粗，顯色較深。這表明利福平刺激后可增強PXR蛋白在EC9706細胞核內表達(圖2)。以上結果表明，利福平預處理后，可活化PXR，增強其核蛋白表達水平。

2.2.2 利福平活化PXR對食管癌細胞增殖的影響 在10 μmol/L利福平作用下，EC9706細胞增殖明顯加快，第3、5、7天的490 nm波長處吸光度值(OD)分別為：0.682±0.048、1.183±0.156、1.817±0.095;而0.1%DMSO處理對照組相應的OD值分別為：0.528±0.035、0.920±0.036、1.402±0.092。相應時間內，利福平組OD值均明顯高于DMSO組(P＜0.05)。而第1天，利福平組和DMSO組OD值〔(0.155±0.006)vs(0.163±0.004)〕之間沒有顯著差異(P＞0.05)。結果表明利福平活化PXR后，可促進EC9706細胞增殖。見圖3。

圖2 利福平處理EC9706細胞后PXR表達變化

圖3 利福平對EC9706細胞增殖的影響

2.3 PXR在抗ADM誘導EC9706細胞凋亡中的作用

2.3.1 流式細胞儀觀察到的ADM處理空白組和PXR+利福平組EC9706細胞的增殖周期 在1 μg/ml阿霉素作用下，DMSO組EC9706細胞增殖明顯加快，相應時間內，利福平組OD值均明顯低于DMSO組(P＜0.05)。結果表明利福平活化PXR后，可抑制EC9706細胞增殖。見圖4。

2.3.2 MTT觀察ADM處理空白組和PXR+RIF組EC9706細胞的凋亡率 在1 μg/ml ADM作用下，ADM處理的DMSO組EC9706細胞凋亡明顯增多(P＜0.01);ADM處理的RIF組EC9706細胞凋亡明顯增多(P＜0.01)。結果表明利福平活化PXR后，再用利福平處理后可降低EC9706細胞的凋亡率。見圖5。

2.3.3 Western印跡檢測ADM對利福平與DMSO組EC9706細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 ADM處理EC9706細胞后Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達，以光密度指數(OD)表示三種蛋白表達的相對含量。所有樣品檢測均以DMSO處理組細胞為空白對照，用ipp7c軟件計算出Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的OD值。ADM處理的PXR+利福平組的Caspase-3蛋白的FI值均低于對照組;Bcl-2蛋白的OD值均高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。但Bax蛋白的OD值與對照組相比，則無明顯差異(P＞0.05)(圖6)。

圖4ADM處理DMSO組和RIF組對EC9706細胞增殖的影響

圖5ADM處理DMSO組和RIF組EC9706細胞凋亡率的影響

圖6 Western印跡檢測ADM處理DMSO組和利福平組EC9706細胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

2.3.4 免疫組化法觀察到ADM處理的DMSO組和RIF+PXR組的Caspase-3，Bcl-2，Bax的表達情況 Caspase-3主要定位于細胞質，也可見于細胞核。Bcl-2和Bax定位于細胞質，亦可見于胞膜和核膜。著色明顯高于背景，在相應部位出現棕黃色顆粒者為陽性細胞，不著色或顯色強度與背景無差別者為陰性細胞。見圖7。

圖7 免疫組化法觀察到ADM處理的兩組Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達情況(×400)

3 討論

PXR可通過上調多重抗凋亡基因包括 BAG3、BIRC、2MCL-1，下調凋亡基因如 BAKl、TP53/P53，Bcl-xL而起到對抗細胞凋亡的功能，從而對抗 DCA/LCA誘導的結腸癌變〔3〕。Daisuke等〔4〕報道PXR在食管鱗癌中是高表達的，而且是判斷ESCC患者的一種潛在的預后因子。

ADM是一種常見的抗腫瘤藥物，其抗瘤譜較廣，對乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多種癌癥都有一定療效，而且是治療食管癌效果最好的化療藥物之一。ADM屬細胞周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。已有文獻報道，ADM誘導細胞凋亡的分子機制，可能是由于其部分分子結構可嵌入到DNA雙鏈中形成穩定的復合物，影響DNA的結構和功能，阻止DNA復制和RNA的合成，還能抑制拓撲異構酶Ⅱ的功能，從而抑制腫瘤細胞的分裂和增殖〔1〕。有研究證實PXR的配體利福平及其他配體可增強CYP3A4和MDRl表達，前者可代謝50%以上的處方藥，其中也包括部分抗癌藥物。PXR配體具有泛宿主性，一些抗癌藥如紫杉醇、順鉑等也是其配體，可通過PXR誘導MDRl表達，并可被酮康唑抑制〔5〕，這些研究提示PXR與EC9706細胞的抗凋亡調控相關。

PXR的表達部位主要在肝臟、小腸、腎臟及血腦屏障等組織細胞，這與經其轉錄激活的下游靶酶或蛋白如 CYP3A4、CYP2B6、UGT1A1、MDR1等的表達部位基本一致。近年來在眾多腫瘤組織中也發現了PXR的高表達，研究表明高表達PXR的腫瘤譜已經從早期的性激素相關腫瘤得到了很大范圍的擴展。在結腸癌〔6〕中也發現了PXR的表達并證實了與多藥耐藥的相關性。最近，在食道鱗狀上皮癌組織中，PXR蛋白及mRNA水平均明顯高于正常食道上皮組織〔2〕。

PXR抑制腫瘤細胞凋亡也可能是其誘導耐藥的機制之一。在人結腸癌細胞中，PXR活化導致了抗凋亡基因，如 BAG3，BIRC 2，MCL-1等表達上調，而包括BAK1和TP53在內的促凋亡基因表達受到抑制〔7〕。可是Verma等〔8〕卻發現了相反的結果。他們在人乳腺癌細胞系MCF-7和ZR-75-1中發現，PXR的活化也可以通過一氧化氮(NO)依賴的途徑上調 p53的表達，進而導致促凋亡因子p21、PUMA、BAK表達增加，促進了乳腺癌細胞的凋亡。PXR對細胞凋亡的作用可能和性激素的表達水平及PXR對NO的誘導作用的強弱有關，具有一定的組織特異性，從而為研究化療藥物的選擇性和與激素類藥物的聯合用藥方面提供了參考。

本實驗發現PXR基因與凋亡蛋白Caspase-3在食管鱗癌中的表達明顯相關，進一步證實其在食管鱗癌的發生與演進中有著重要的作用與地位，是食管鱗癌治療中的一個靶基因，因此對PXR的研究及應用這些研究成果有望使其成為食管鱗癌診斷和基因、免疫治療的新靶點，為食管鱗癌的診斷、治療開辟一條新途徑。本研究證明，藥理學活化PXR足夠抑制阿霉素誘導的EC9706細胞的凋亡，基因表達分析說明PXR的抗凋亡作用與多種凋亡相關基因的調控有關。PXR作為抗腫瘤細胞凋亡作為在腫瘤的治療新靶點方面已引起重視，本研究為PXR在食管癌中的治療作為新的靶點提供了理論依據。

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R329

〕 A 〔

1005-9202(2012)22-4962-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.051

樊青霞(1952-)，女，主任醫師，主要從事惡性腫瘤研究。

謝晶華(1987-)，女，碩士，主要從事惡性腫瘤研究。

〔2011-12-17收稿 2012-04-05修回〕

(編輯 趙慧玲)