變應性鼻炎患者外周血CD4+CD25+Treg及Foxp3的檢測及意義

王淑慧 王桂琴

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是發生在鼻黏膜的變態反應性疾病，以鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進，鼻黏膜腫脹為主要特點，是嚴重影響人類生活質量的變態反應性疾病。在上個世紀九十年代中期，由Sakaguchi等首先證實了天然CD4+CD25+Treg為一類具有免疫抑制作用的T細胞，約占外周CD4+T細胞的5% ～10%［1］。這群細胞具有免疫耐受和免疫抑制兩大特性，對維持機體免疫的穩定性起著重要的調節作用。Treg細胞常用的分子標記有CD25、Foxp3(叉頭/翼狀螺旋轉錄因子)等，其中Foxp3是CD4+CD25+Treg的特異性標志，是調節性T細胞發育的一個重要開關［2］。目前調節性T細胞的研究已受到學術界的廣泛關注，但是其在變應性鼻炎發病中的作用還不是很明確。本文采用流式細胞術分析變應性鼻炎患者外周血PBMC中CD4+CD25+Treg、CD4+CD25highTreg及Foxp3占外周血T細胞的百分比，以進一步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年1月至2011年12月在山西省汾陽醫院就診的30例AR患者(男16例，女14例，年齡16～53歲，平均30.1歲)，15例健康者作對為照組，來自本院體檢的健康人群，均取得本人同意(男8例，女7例，年齡 25～45歲，平均31歲)。以上所有受試對象均排除其他急慢性疾病，8周內未用抗組胺、糖皮質激素。

1.2 主要試劑和儀器 FITC標記的CD25、PC5標記的CD4均購自美國BD公司;PE標記的Foxp3，固定劑，破膜劑，稀釋液以及淋巴細胞分離液均購自eBiosciense公司，EPICS XL流式細胞儀為美國Beckman-Coulter公司。

1.3 檢測方法 所有檢測對象均于清晨空腹采集靜脈血2 ml加入EDTA抗凝管制備單個核細胞(PBMC)懸液，加入PC5-CD4、FITC-CD25單克隆抗體20μl，室溫避光孵育 30 min，并PBS洗滌1次，棄上清。加入新鮮配制的固定/破膜液1 ml，4℃避光 30～60 min，用固定/破膜緩沖液2 ml洗滌2 次，加入 Foxp3-PE20μl，4℃ 避光 30 min，用固定/破膜緩沖液2 ml洗滌2次，棄上清，加入 0.5 mlPBS，4 h內上流式細胞儀檢測。流式細胞檢測采用 EPICS XL流式細胞儀，應用Cell Quest軟件進行結果分析，在 FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，以CD4細胞群和 SSC設門，選擇 CD4+細胞分析CD25和Foxp3表達，將 CD4 CD25細胞群平均熒光強度＞7.0的亞型細胞群定義為CD4 CD25highT細胞，結果以CD4+CD25+T細胞、CD4+CD25highT細胞和Foxp3占CD4+T細胞的百分率表示。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0軟件處理資料，結果均采用±s表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

流式細胞技術檢測結果顯示，AR組 CD4+CD25+/CD4+、CD4+CD25high/CD4+T細胞百分比及Foxp3表達與正常對照組相比明顯減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1

3 討論

流行病學的研究證實，近年來，變應性鼻炎的發病率在全球范圍內逐漸升高，除了環境因素以外，越來越多的研究證實變應性鼻炎是一種多基因疾病，且具有明顯個體差異和地域性，這都為變應性疾病的研究帶來一定困難。過去較為認同的是T細胞分化調節假說，一直以來認為Th1/Th2免疫失衡是變應性鼻炎發病機制中的主要環節，然而，進一步的研究發現，Th1細胞是前炎性細胞，其促炎癥作用超過了抗炎作用，與Th1相關的炎癥反應并不下調變應性鼻炎。而在Th2細胞介導的免疫反應疾病中，變應性鼻炎的發病率也并未增高［3-4］。說明單純的Th1/Th2失衡理論不足以解釋變應性鼻炎的發病機制。最近，一種在過敏性炎癥反應中發揮較強免疫抑制功能的T細胞受到廣泛關注，這一細胞群被稱為調節性T細胞(Treg)。Treg細胞對Th1反應和Th2反應均表現為抑制作用，以起到維持機體自身穩態的作用。其中CD4+CD25+Treg細胞作用最強，研究它的免疫調節作用及其機制是近年來的研究熱點。CD4+CD25+Treg表達多種表面分子，Foxp3是目前公認的CD4+CD25+Treg細胞的特異性標志［5］。除作為分子標記外，Foxp3介導 CD4+CD25+Treg在胸腺的發育、外周的表達及功能的維持，可反映CD4+CD25+調節性T細胞的活性水平［6］。CD4+CD25+Treg的這種調節作用可能在AR中存在缺失或缺陷，導致CD4+CD25+Treg對樹突狀細胞活化的抑制作用減弱，以及對Th2細胞的增殖作用降低，進而不能夠阻止針對變應原的Th2型反應。有研究表明，變應性鼻炎患者外周血PBMC中CD4+CD25+Treg的比率低于正常人，同時鼻黏膜中Foxp3的表達降低［7］。但也有研究表明CD4+CD25+Treg細胞數量無明顯差別甚至增加，但 Treg細胞不能發揮正常的免疫抑制功能［8］。

本研究結果顯示，變應性鼻炎患者外周血PBMC中的CD4+CD25+Treg細胞及Foxp3比例明顯低于正常人，進一步證實了Treg細胞數量不足和(或)功能缺失在變應性鼻炎發生發展中的意義。雖然目前直接將Treg細胞用于治療AR的報道較少，但是，隨著變應性鼻炎發病機制的深入研究，升高Treg細胞數量或增強其活性有利于Treg細胞調節作用的發揮，可能在AR的免疫治療中獲得廣泛的應用前景。

［1］Beissert S，Schwarz A，Schwarz T.Regulatory T cells.J Inwest Dermatol，2006，126:15-24.

［2］Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.Science，2003，299(5609):1057-1061.

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［4］Halvor S，Devendra K，Agrawal G.Th2 Cells in the Pathogenesis of Airway Renodeling .Immunol Res，2006，35(3):219-231.

［5］Lopes JE，Soper DM，Ziegler SF.Foxp3 is required throughout the life of a regulatory T cell.Sci Stke，2007(393):36-42.

［6］Marson A，Kretschmer K，Frampton GM，et al.Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation.Nature，2007，445(7130):931-935.

［7］Xu G，Mou Z，Jiang H，et al.A possible role of CD4+CD25+T cells as well as transcription factor Foxp3 in the dysregulation of allergic rhinitis.Laryngoscope，2007，117(5):876-880.

［8］Fougeray S，Brignone C，Triebel F.A soluble LAG-3 protein as an immunopotentiator for ther-apertic vaccines:preclinical evaluation of IMP321.Vaccine，2006，4(26):5426-5433.