正交法優(yōu)選夜寧膠囊中靈芝鎮(zhèn)靜成分提取工藝的研究

周曉東 李瑩 丁青龍

正交法優(yōu)選夜寧膠囊中靈芝鎮(zhèn)靜成分提取工藝的研究

周曉東 李瑩 丁青龍

目的 用正交試驗研究中藥靈芝中鎮(zhèn)靜成分的提取工藝。方法 采用四因素三水平的正交實驗設(shè)計，以出膏率和靈芝多糖及總糖含量為指標，用紫外分光光度計測定浸膏中靈芝多糖及總糖含量，篩選最佳工藝條件。結(jié)果 40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸騰狀態(tài)2 h為最佳工藝。結(jié)論 以正交試驗法優(yōu)選的靈芝鎮(zhèn)靜成分提取工藝方法簡單，結(jié)果穩(wěn)定，效果滿意，從而確保質(zhì)量。

靈芝;靈芝多糖;總糖;提取工藝;正交試驗

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang 的干燥實體。在中醫(yī)臨床應(yīng)用已有悠久的歷史，自古認為有益氣血，安心神，健脾胃之功效。主治虛勞，心悸，失眠，頭暈，神疲乏力，久咳氣喘等。古代很多文獻對其都有記載：《新修本草》：“芝安心神”，《本草綱目》：“紫芝療虛癆”;《中國藥用植物圖鑒》：“治神經(jīng)衰弱、失眠、消化不良等慢性疾病?！?《中國中草藥匯編》：“滋養(yǎng)強壯。主治頭暈，失眠，神經(jīng)衰弱，高血壓病，血膽固醇過高癥，肝炎，慢性支氣管炎，哮喘等病?！?《中國傳統(tǒng)補品補藥》：“養(yǎng)心安神，補肺益肝。適用于血不養(yǎng)心，心悸失眠健忘，肺虛咳喘，久咳不好，以及肝炎恢復(fù)期，神疲納呆等癥。”。

現(xiàn)代藥理研究證明其醇水提取液可明顯增強戊巴比妥鈉的中抑制作用(翻正反射消失)，并有抗電驚厥作用［1］。本文采用分光光度法測定了靈芝醇水提取物中總糖及靈芝多糖的含量，方法簡便快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可作為靈芝提取物的質(zhì)量及工藝的控制方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

原料：干燥實體多孔菌科真菌赤芝。試劑：乙醇，苯酚，硫酸等試劑均為分析醇，水為重蒸餾水，堿性酒石碳酸銅溶液試藥：99.99%葡萄糖。

1.2 儀器

752型紫外分光光度計(上海分析儀器廠);FQC-100超聲波清洗機(無錫福尼達電子公司，40KHz)80-2型臺式離心機(上海分析器械廠);電子分析天平，RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青鋪滬西儀器廠)，SC202-1型電熱恒溫干燥箱(通州市滬通制藥機械設(shè)備廠)，F(xiàn)A1004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，植物粉碎機(中國天津泰新特儀器有限責(zé)任公司)

1.3 方法

1.3.1 提取方法 分別采用回流提取法、超聲提取法、浸漬提取法，應(yīng)用L9(34)正交表實施實驗

1.4 靈芝在不同提取工藝和不同濃度的乙醇溶液中的總糖和靈芝醇溶性多糖的含量測定。

1.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖9.8 mg置100 ml容量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4.2 樣品溶液的制備 精密稱取各組正交試驗105℃干燥至恒重的靈芝浸膏等量于離心管中中加水至10 ml，超聲30 min溶解，定容至10 ml，得總糖供試液(1)。將總糖供試液用85%乙醇處理至無單糖存在(用堿性酒石酸銅檢查)得多糖供試液(2)［2］。

1.4.3 測定波長的選擇 分別取標準儲備液2.0 ml，樣品液0.2 ml，陰性對照液0.2 ml，以同量蒸餾水為空白，按標準曲線項下操作后，在UD光度計上對400～600 nm波長區(qū)間進行掃描，得最大吸收波長λmax為490 nm，并且在此波長處陰性對照液的吸光度值在0.005以下，不影響測定，故選用490 nm 為測定波長［3］。

1.4.4 標準曲線的制備 分別精密吸收0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml標準液于10 ml容量瓶中加蒸餾水至1.0 ml分別加新配制的5%苯酚1.5 ml再加98%H2SO47.5 ml，充分搖勻置室溫下反應(yīng)20 min至恒溫后在490 nm處測吸收度［4］，并進行回歸處理：A=665.8163C-0.0357，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。

1.4.5 供試品溶液的測定 分別精密量取樣品溶液(1)、(2)0.2 ml，按標準曲線項下操作，測得吸收度，根據(jù)回歸方程計算含量。

1.5 提取工藝

1.5.1 原藥材的處理 取靈芝原藥材，粉碎，過目篩分樣，置65℃烘箱中烘2 h，置干燥器中冷卻至室溫，備用。

1.5.2 回流提取法

1.5.2.1 工藝流程 稱取不同目數(shù)藥材5 g→回流提取→抽濾→回收乙醇→測定浸膏量、靈芝多糖和總糖含量。

1.5.2.2 因素-水平表

3.2.3 正交表 L9(34) 加權(quán)評分公式為：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.2198

表1

表2

加權(quán)評分結(jié)果確定：A1B3C2D3其中RA＞RB＞RC＞RD

即回流最佳提取工藝為：40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸騰狀態(tài)2 h。

3.3 超聲提取法

3.3.1 工藝流程 稱取藥材粉末→超聲提取→抽濾→回收溶劑→測定總糖、多糖含量、測定浸膏量。

3.3.2 因素-水平表

表3

3.3.3 正交表 L9(34) 加權(quán)評分公式為：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.8037

表4

加權(quán)評分結(jié)果確定：A1B3C1D3其中RD＞RA＞RB＞RC

即超聲最佳工藝為：＞40目藥材粉末加相當于藥材30倍量的70%乙醇超聲20 min。

3.4 浸漬提取法

3.4.1 工藝流程 稱取不同目數(shù)藥材粉末1 g→浸漬不同天數(shù)→回收溶劑→測定總糖、多糖含量、測定浸膏量

3.4.2 因素-水平表

表4

3.4.3 正交表 L9(34) 加權(quán)評分公式為：y=0.5y1+0.3y2+0.2y3+5.4647

表5

加權(quán)評分結(jié)果確定：A1B3C2D3其中RA＞RD＞RC＞RB

確定最佳工藝為：40倍量的70%乙醇，大于40目的靈芝粉浸漬8 d。

3.5 最佳工藝的確定

選擇回流提取法、浸漬提取法和超聲提取法中的最佳工藝條件，每組重復(fù)五次，結(jié)果如表所示。其中加權(quán)評分公式為：

表6

兩兩比較三個總體均數(shù)的差異

表7

4 結(jié)果處理

先將回流組和超聲組作比較：ta=(X1－X2)/(Sw√n1-1+n2-1)=23.9788對 α =0.05，f=5+5-2=8，查表得 t0.05/2(8)=2.306故|t|＞tα/2即P＜0.05，故回流組和超聲組其差異有顯著性意義，且回流組高于超聲組。

再將含量較高的回流組和浸漬組作比較：ta=6.2820，即|t|＞tα/2，P＜0.05，故回流組和浸漬組的差異也有顯著性意義，且回流組高于浸漬組。經(jīng)過兩兩正態(tài)總體均數(shù)的差異的比較可知：回流組評分分別高于另外超聲，浸漬兩組。因此得出：40倍量的60%乙醇，80℃回流2 h，即保持沸騰狀態(tài)2 h為最佳工藝。

5 討論

本實驗利用正交表，對多因素、多水平且各因素間存在相互作用而具有隨機誤差的試驗，通過少數(shù)代表性強的試驗，利用統(tǒng)計分析方法，較快地找出合理的試驗方案，省時省力，方法可取。

由于正交試驗時無空白對照組且無重復(fù)試驗，故只采用了直觀方差分析法。在三種方法的最佳工藝確定時，采用了以少量樣本比較正態(tài)總體均數(shù)差異的方法，可信度較高。

現(xiàn)代藥理研究表明靈芝的醇提液對實驗動物的中樞神經(jīng)有明顯的抑制作用，有協(xié)同本巴比妥的對中樞神經(jīng)的以致作用，因目前對靈芝的質(zhì)量還沒有可靠的標準?？紤]到靈芝中有部分醇溶性的糖，而目前對靈芝研究較多的也就是其中的糖類物質(zhì)，故以其中的醇溶性的糖作在提取過程中的一個考察指標。

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草·上冊(精選本).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1996，172.

［2］仇萍，袁濤，王美麗.靈芝口服液中靈芝多糖含量測定方法研究.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，2000，6(3)：37.

［3］單衛(wèi)華，張玲，時延增，梁瑞雪，尚立霞，胡慶文.靈芝菌酵液制劑中靈芝多糖及總糖含量測定.時珍國醫(yī)國藥，2000，11(9)：797.

［4］張春華，周永治，劉延福，等.數(shù)理統(tǒng)計方法.山東大學(xué)出版社，1994：151-181，250.

211131 南京軍區(qū)總醫(yī)院湯山分院藥械科(周曉東);南京中醫(yī)藥大學(xué)(李瑩 丁青龍)

1.3.2 浸膏得率的測定

1.3.2.1 蒸發(fā)皿的預(yù)處理 蒸發(fā)皿置烘箱中105℃烘1 h，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W1，繼續(xù)烘30 min，置干燥器中冷卻至室溫，稱重W2，當W1與W2差之絕對值≤0.3 mg時，置干燥器中備用。

1.3.2.2 浸膏量的測定 剩余提取液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓回收溶劑至稠膏狀，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置烘箱中105℃干燥2 h得干浸膏，稱重W，計算W-(W1+W2)/2值。