應用EMA-PCR檢測沙門氏菌活菌的研究

趙素君 曹 冶 謝 晶 李江凌 王秋實 葉勇剛 羅丹丹 葉健強 廖黨金

（四川省畜牧科學研究院，成都 610066）

沙門氏菌（Salmonella）是腸桿菌科中一種重要的人畜共患病原菌，分布廣泛，血清型繁多。常因污染飼料、水源、土壤、畜舍設施等造成畜禽感染。感染畜禽后可引起雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒、流產等多種動物疾病?；疾⌒笄蒹w內含有大量的沙門氏菌，在其排泄物中也經常帶菌，因而成為新的傳染源，如不及時檢測發現和控制處理，則可導致畜禽間及養殖場間的水平傳播，甚至垂直傳播給子代畜禽。為有效地預防和控制疾病發生，建立快速、敏感而又特異的檢測沙門氏菌的方法是非常必要的。長期以來，人們對沙門氏菌的檢測大多采用傳統的方法，即選擇性或非選擇性增菌、可疑細菌的分離、生化反應及血清學鑒定等常規方法，檢測結果雖然在一定程度上準確、可靠，但檢測過程煩瑣、費時費力，而且腸桿菌科細菌間的生化反應多有交叉，因此，傳統的檢測方法在快速、敏感與特異性等方面存在一定的局限性[1，2]。

近年來，PCR技術以靈敏度高、特異性強、簡便和快速等優點作為分子水平的快速檢測技術越來越多的被應用于沙門氏菌的檢測中[3-5]。沙門氏菌的侵襲蛋白決定細菌進入宿主上皮細胞的能力，與沙門氏菌的致病性密切相關。其中，invA基因編碼的侵襲蛋白A是吸附和侵襲上皮細胞的表面抗原，是主要毒力因子，在沙門氏菌的致病過程中起著重要作用[6-8]。invA基因序列在沙門氏菌屬具有很高的同源性，非常保守。是當前沙門氏菌檢測的主要靶點[9]。

由于樣品中常常存在死亡沙門氏菌，死菌雖然已經沒有危害性，但在PCR檢測中也能擴增出目的基因，從而使檢測結果出現大量的假陽性，干擾了檢測的真實性。所以區分死、活細菌方法的建立對沙門氏菌檢測極其重要。本研究利用疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）能穿過死細菌的細胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴增的特性，將EMA與PCR技術結合，通過特異性擴增編碼侵襲蛋白A的invA基因，建立一種快速、有效的檢測沙門氏菌活菌的方法，具有很好的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 陽性菌株：豬霍亂沙門氏菌CVCC504、鼠傷寒沙門氏菌CVCC541、雞白痢沙門氏菌CVCC525；對照菌株：金黃色葡萄球菌CVCC3055、CVCC3056；腸毒性大腸桿菌CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC215，腸出血性大腸桿菌CVCC248，腸侵襲性大腸桿菌CVCC2072，腸致病性大腸桿菌CVCC251，均購自中國獸醫藥品檢查所中國獸醫微生物菌種保存管理中心。

1.1.2 主要試劑 EMA為Biotium公司產品；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker購自Takara公司；其他化學試劑均為國產分析純；引物合成及核酸測序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 引物設計與合成 根據GenBank中沙門氏菌invA基因序列設計特異性引物，引物序列為F：5′-GATTCTGGTACTAATGGT GATGATC-3′；R：5′-GCCAGGCTATCGCCAATAAC-3′，擴增目的片段長度為285bp。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌活菌和死菌的制備 接種沙門氏菌CVCC504，培養16 h后，取1ml菌液于EP管中，6 000 rpm，4℃，離心5 min，收集菌體沉淀，加入無菌生理鹽水重懸沉淀，制成活菌懸液。再將活菌懸液72℃水浴15 min，得到死菌懸液。

1.2.2 EMA處理 取適量菌懸液于EP管中，加入終濃度為100μg/ml 的EMA，在黑暗處放置5min后，于650W鹵素光源光照處理1min，光源放在離樣品管20cm處，光照時EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。EMA處理后的樣品，用于下面的DNA模版的制備。

1.2.3 模版DNA的制備 取1 ml菌液，12 000 rpm離心5 min，去除上清液，然后用100 ul滅菌去離子水重懸。然后，100℃水浴5 min后，再10 000 rpm離心5 min，上清液用作PCR檢測。

1.2.4 PCR反應體系及反應條件優化 PCR反應體系：10×Ex Taq Buffer（含MgCl2）2.5μl，dNTP mixture（各2.5mM）2μl，引物（20μM）各0.5μl，模板DNA 1μl，TaKaRa Ex Taq（5 U/μl）0.2μl，滅菌雙蒸水加至25μl。

PCR反應條件優化主要通過退火溫度來實現，為了獲得特異性的擴增片段，采用Touchdown PCR方法確定PCR反應合適的退火溫度，設定退火溫度范圍65℃～45℃。擴增結果經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 PCR特異性檢測 以CVCC504、CVCC541、CVCC525作為陽性菌株；以CVCC3055、CVCC3056、CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC248、CVCC251、CVCC2072作為對照菌株，進行PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統進行觀察，出現特異性擴增條帶，即為檢測陽性，否則為陰性。

1.2.6 PCR靈敏度檢測 接種沙門氏菌CVCC504，培養16 h，取1ml菌液于EP管中，遞倍稀釋10-1～10-9，進行如上模板DNA制備，PCR檢測其靈敏度。同時，采用平板法進行細菌計數，通過牛肉膏蛋白胨瓊脂平板進行對照計數。分別取遞倍稀釋100～10-9的菌液50μl進行涂板，37℃過夜培養，然后分別進行計數，計算檢測靈敏度。

1.2.7 不同活細胞比例的混合菌懸液的EMA-PCR擴增 分別配制含有100%、75%、50%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0%的沙門氏菌CVCC504活細胞菌懸液混合體系，分別加入終濃度為100μg/ml 的EMA，在黑暗處放置5min后，樣品置于冰上用650W鹵素光源距離20cm處光照處理1min，經EMA處理后的菌液，用于如上DNA模版的制備，進行PCR擴增。

2 結果

2.1 PCR反應條件的優化結果

經過Touchdown PCR方法確定最佳的PCR反應條件為：94°C 4min；94°C 30sec、55°C 30sec、72°C 30sec，28個循環；72°C延伸5min。

2.2 沙門氏菌invA基因的PCR特異性檢測結果

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示（見圖1），只有沙門氏菌CVCC504、CVCC541、CVCC525擴增出285bp的目的條帶，DNA測序結果經BLAST分析，與GenBank上序列完全一致。而對照菌株CVCC3055、CVCC3056、CVCC196、CVCC197、CVCC200、CVCC211、CVCC248、CVCC251、CVCC2072均未檢測到特異性條帶，結果為陰性。

2.3 沙門氏菌invA基因的PCR檢測靈敏度分析

將各梯度稀釋液100～10-9分別進行invA基因的PCR擴增，結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示其靈敏度檢測低限為10-9，而相應的平板計數為11CFU/ml。

2.4 沙門氏菌EMA-PCR區分死菌與活菌的檢測結果

EMA-PCR擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示除了全部是死菌的組外，其他含活菌各種比例的混合菌液中，均出現特異性擴增條帶，見圖3。

3 討論

疊氮溴乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）是一種熒光插入型的核酸結合染料，能穿過死細菌的細胞膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴增；而完整未受損傷的活菌細胞膜能阻止EMA滲透，對活菌DNA不起作用[10，11]。PCR檢測方法的特異性與靈敏度主要取決于相應檢測靶點的選擇，invA作為沙門氏菌的持家基因，具有很好的屬內保守性與屬間特異性，本研究選取invA基因作為靶序列設計特異性引物，將EMA與PCR技術結合，成功地建立了一種快速、有效的檢測沙門氏菌活菌的方法。由于在檢測過程中除去了死細胞DNA對PCR的干擾，從而大大提高了檢測結果的準確性和真實性。由于沙門氏菌血清型較多，2001年就已經報道有2523種血清型[12]。本研究旨在提出一種鑒定沙門氏菌活菌的PCR檢測方法，鑒定結果往往需要配合血清型分析鑒定器種類。該方法操作簡單，大大縮短了傳統常規方法的檢測周期，對沙門氏菌的檢測具有較好的應用價值。

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