老年腦梗死患者熱休克蛋白70-1基因的多態性

魏云鴻 金醒昉 何 燕 楊文慧 (昆明市延安醫院 云南省老年病研究中心，云南 昆明 650051)

老年腦梗死患者熱休克蛋白70-1基因的多態性

魏云鴻 金醒昉 何 燕 楊文慧 (昆明市延安醫院 云南省老年病研究中心，云南 昆明 650051)

目的 探討熱休克蛋白70(Hsp70)-1基因多態性與老年腦梗死之間的關系。方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測101例老年腦梗死患者(其中包括腦梗死并高血壓患者67例和腦梗死不合并高血壓患者34例)、115例老年高血壓患者和100例老年健康者Hsp70-1+190位點基因多態性。結果 老年腦梗死組Hsp70-1+190位點GC基因型所占比例(59.41%)高于老年健康組(36%)(P=0.001)。老年腦梗死不合并高血壓組Hsp70-1 GC基因型所占比例(82.35%)分別高于老年腦梗死并高血壓組(47.76%)、老年高血壓組(45.22%)、老年健康組(36%)，OR 值分別為5.104(95%CI：1.871 ～13.925，P=0.001)、5.654(95%CI：2.175 ～14.695，P ＜0.001)、8.296(95%CI：3.140～21.922)(P＜0.000 1)。結論 Hsp70-1基因多態性與老年腦梗死遺傳易感性有關;檢測Hsp70-1+190位點基因多態性將可能作為預測腦梗死發生的一項重要指標。

熱休克蛋白70-1;腦梗死;高血壓;基因多態性

許多證據表明遺傳因素在腦梗死的發病中有顯著作用，腦梗死是由多個基因和環境因素共同作用導致的一類極其復雜的疾病。遺傳因素在腦梗死的病理生理方面起著十分重要的作用。而熱休克蛋白(Hsp)70作為熱休克蛋白中最突出和最具特征性的一類，它主要參與機體耐受的形成〔1〕。當細胞或機體應激時，Hsp70蛋白生成顯著增加，避免機體再次應激時遭受更為嚴重的損傷。研究顯示，Hsp70蛋白水平的動態變化與缺血性腦梗死及其病情的輕重密切相關〔2〕。Hsp70基因多態性是否與腦梗死相關，國內外鮮有報道。為此，本研究對老年腦梗死患者與Hsp70-1基因多態性關系進行了一定的探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象 (1)病例組選自2007年1月至2010年7月間云南省昆明市延安醫院干療/老年病科住院患者，包括老年腦梗死(均為動脈硬化性腦梗死，以后簡稱腦梗死)組101例(包括腦梗死并高血壓組患者67例，腦梗死不合并高血壓組患者34例)、老年高血壓組115例，均為昆明地區漢族;所有病例高血壓診斷符合1999年世界衛生組織與國際高血壓學會制定的高血壓診斷標準，腦梗死診斷符合《實用內科學》第12版制定的動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷標準，所有研究對象均排除瓣膜性心臟病、雙下肢靜脈血栓、房顫、血液病、顱內腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等引起的繼發性腦卒中。(2)老年健康組來自研究期間就診于云南省昆明市延安醫院體檢中心的昆明地區漢族人群，經各項體檢健康，并排除高血壓、腦梗死、神經、心理疾病、自身免疫性疾病、癌癥及其他慢性疾病。三組研究對象年齡、性別、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和尿酸(UA)之間無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 受檢者禁食12 h后，于清晨取用EDTA抗凝管取靜脈血2 ml，并將血標本保存于-80℃冰箱中準備提取基因組DNA。

1.2.2 DNA的提取 基因組DNA的提取使用AXYGEN公司“AxyPrep血基因組DNA試劑盒”從全血中提取并保存于-80℃冰箱中。

1.2.3 目的片段聚合酶鏈反應(PCR) (1)用Primer 5.0設計引物序列，由上海生物工程有限公司(Sangon)合成，上游引物5'-AAAGGCGGGTCTCCGTGAC-3'，下游引物5'-TTGGCGATGATCTCCACCTT-3'，PCR目的片段長度為359 bp。(2)PCR反應：PCR 反應體系為25 μl，包括Fermentas公司PCR Master Mix(2 × )12.5 μl、上下游引物各 0.5μl、DNA 模板 3 μl，使用：美國BIO-RAD公司梯度PCR儀進行反應，PCR反應條件為95oC變性 5 min 后，按 95℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 30 s，反復循環35次，最后72℃延伸5 min。PCR擴增后，取2 μl PCR反應產物做瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

1.2.4 限制性內切酶法檢測Hsp70-1基因型 將PCR擴增產物用限制性內切酶BrsB I(Fermentas公司)在37℃恒溫箱中消化24 h，359 bp的PCR擴增產物DNA被BrsB I酶切后用2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段，若出現116和243 bp兩條條帶，判定為GG純合基因型;若出現116、243和359 bp三條條帶，判定為GC雜合基因型;若出現359 bp一條條帶，判定為CC純合基因型。

1.2.5 基因測序 對Hsp70-1 PCR擴增后的目的條帶進行基因測序，每種基因型不少于10%的檢測量，未被酶切開的一條帶純合基因型全部送檢(基因測序委托上海生工完成，所用測序儀器為ABI-PRISM3730，測序試劑為BigDyeterminator v3.1)。將測序結果與酶切結果比對后發現，符合率達100%。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件對所有實驗結果進行統計學分析。計量資料符合正態分布，以±s表示，兩組之間計量資料比較用t檢驗，兩組以上比較采用單向方差分析;計數資料以頻數和百分比表示，計數資料比較用χ2檢驗。采用Logistic回歸分析計算特定危險因素的比值比(OR)及其95%置信區間(CI)。

2 結果

2.1 各組基本資料比較 各組基本資料比較見表1。各組研究對象除空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白(HDL)比較具有統計學差異(P＜0.05)外，五組研究對象的性別、年齡、TC、TG、LDL和UA之間無統計學差異(P＞0.05)。

2.2 Hsp70-1 PCR反應產物 電泳后，紫外燈下顯示359 bp電泳帶，見圖1。經BrsB I內切酶酶切后，若酶切結果出現116和243 bp兩條條帶，判定為GG純合基因型;若出現116、243和359 bp三條條帶，判定為GC雜合基因型;若出現359 bp一條條帶，判定為CC純合基因型。電泳結果見圖2?；驕y序驗證結果見圖3。

表1 各實驗組的基本資料比較

圖1 Hsp70-1 PCR擴增目的片段的瓊脂糖凝膠電泳結果

圖2 Hsp70-1 PCR酶切產物電泳圖

2.3 基因型結果

2.3.1 Hsp70-1+190位點各基因型在腦梗死組和健康組中的分布 Hsp70-1基因型在腦梗死組和健康組中的分布頻率差異有統計學意義(P=0.004)，進一步分析發現，與健康組相比，Hsp70-1 GC基因型在腦梗死組中明顯升高，達59.41%，OR為2.602(95%CI：1.472 ～ 4.599)(P=0.001)，說明攜帶 Hsp70-1 GC基因型的個體發生腦梗死的風險明顯增加。而C、G等位基因分布頻率在腦梗死和健康組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

圖3 Hsp70-1 PCR擴增目的條帶測序圖

2.3.2 Hsp70-1+190位點各基因型及等位基因在腦梗死并高血壓組、腦梗死不合并高血壓組、單純高血壓組和健康組中的分布 四組間基因型分布頻率比較：腦梗死不合并高血壓組與腦梗死并高血壓組、單純高血壓組、健康組相比，具有顯著差異(P＜0.005);其余兩組之間比較差異無統計學意義。進一步分析發現，腦梗死不合并高血壓組Hsp70-1 GC基因型所占比例明顯升高，達82.35%，與健康組比較，OR值為8.296(95%CI為3.140～21.922)(P＜0.000 1)，提示攜帶Hsp70-1 GC基因型的個體在無高血壓的情況下，發生腦梗死的風險比另兩種基因型更大。腦梗死不合并高血壓組Hsp70-1 GC基因型所占比例明顯升高，與腦梗死并高血壓組、單純高血壓組比較，OR值分別為5.104(95%CI為1.871 ～13.925，P=0.001)、5.654(95%CI為2.175～14.695，P＜0.001)。見表2。四組間基因頻率分布比較：腦梗死不合并高血壓組與健康組相比，C與T等位基因頻率存在顯著差異(P=0.002)，危險度估計值OR值為2.530，95%CI為1.429～4.480，提示腦梗死不合并高血壓發病率與G、C等位基因頻率有關，即有C等位基因的人群中腦梗死的發生率較G等位基因更大。腦梗死不合并高血壓組與單純高血壓組相比，有顯著差異(P=0.008)，危險度估計值OR值為2.209，95%CI為1.268～3.849。其余兩組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 Hsp70-1+190位點各基因型及等位基因在各組中的分布〔n(%)〕

3 討論

動脈硬化性腦梗死是指由于腦部血液供應障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化，其發病原因復雜。Duggirala等〔3〕認為遺傳因素在卒中的發生中所占比重大約為66% ～74.9%。熱休克蛋白(Hsp)是一個多基因家族，本身就提示其在漫長的生物進化過程中同時存在著遺傳和變異，主要功能是幫助細胞適應一些應激反應。目前研究發現，Hsp70在心臟〔4〕和大腦〔5〕具有細胞保護作用;在發生腦梗死的不同個體中，淋巴細胞Hsp70的表達水平不同，病情的嚴重程度及預后也不同〔2〕;也有研究顯示，Hsp70基因多態性與腦梗死發生的重要危險因素高血壓、動脈粥樣硬化等有關〔6〕。

Hsp70-1基因定位于6p21.3區MHCⅢ 類分子內，其編碼的蛋白質呈結構性低水平表達，可以被熱、腦缺血等誘導。Hsp70-1 基因在-110(A/C)，120(T/C)，190(G/C)和 438(C/T)有多態性位點，研究較多的是190(G/C)位點。

目前有關Hsp70-1基因多態性與疾病關系研究較多的是自身免疫性疾病和炎性疾病〔7〕。Ridker等〔8〕研究發現體內持續的低水平的炎性反應是導致動脈粥樣斑塊和血栓形成的主要因素，而后兩者是腦梗死的主要危險因素。有研究發現〔2〕，Hsp70能夠減輕缺血、缺氧對神經細胞的損害。本研究結果提示G、C等位基因單獨對 mRNA的轉錄影響不明顯，只有Hsp70-1基因+190位點為GC雜合子時才降低了mRNA的轉錄，從而降低了Hsp70的蛋白水平，使機體對腦缺血、缺氧應激的耐受性下降，這可能使腦梗死發生率升高，其中的病理機制可能是：(1)Hsp70-1基因+190位點位于該基因5'側翼區，核苷酸的替換影響了啟動子的功能;(2)該位點核苷酸的改變可能影響到mRNA的轉錄，從而對誘導性Hsp70表達水平產生影響。本研究結果與Liu等〔9〕人研究深圳市漢族Hsp70-1基因+190 G/C多態性與缺血性腦卒中相關的結果相似;但與Zee等〔10〕研究結果不一致，其原因可能是ZEE研究的對象都是來自高加索人群(白種人)，可能存在基因與基因，基因與環境的交互作用。

高血壓是腦梗死最重要的獨立危險因素。但本研究結果提示Hsp70-1+190位點基因多態性可能是腦梗死除高血壓之外的比較特異性的危險因素，針對無高血壓病史的患者，攜帶Hsp70-1+190位點CG基因型的個體要比其他兩種基因型患腦梗死的概率高。而針對腦梗死并高血壓組，該位點基因多態性與腦梗死不合并高血壓組有差異，與單純高血壓及健康組均無差異，說明Hsp70-1+190位點基因多態性對高血壓患者發生腦梗死的幾率無明顯影響。

總之，通過本研究我們發現Hsp70基因多態性在腦梗死的發生發展中具有重要價值，其中Hsp70-1+190位點GC基因型在腦梗死患者特別是腦梗死不合并高血壓患者中明顯升高，因此，檢測腦梗死患者Hsp70-1+190位點基因型，將可能作為預測腦梗死發生的一項重要指標，并為進一步探索腦梗死的發病機制提供了一條新途徑。

1 Brodsky JL，Chiosis G.HSP70 molecular chaperones：emerging roles in human disease and identification of small molecule modulators〔J〕.Curr Top Med Chem，2006;6：1215-25.

2 Jin X，Xiao C，Tanguay RM，et al.Correlation of lymphocyte heat shock protein 70 levels with neurologic deficits in elderly patients with cerebral infarction〔J〕.Am J Med，2004;117(6)：406-11.

3 Duggirala R，Villalpando CG，O'Leary DH，et al.Genetic basis of variation in carotid artery wall thickness〔J〕.Stroke，1996;27(5)：833-7.

4 豐浩榮，許鵬程，徐進步，等.大鼠局灶性腦缺血-再灌注時ε型蛋白激酶與熱休克蛋白70表達變化及相關性〔J〕.中國微循環，2008;12(2)：271-5.

5 Rajdev S，Hara K，Kokubo Y，et al.Mice overexpressing rat heat shock protein 70 are protected against cerebral infarction〔J〕.Ann Neurol，2000;47(6)：782-91.

6 Tranter M，Ren X，Forde T，et al.NF-kappaB driven cardioprotective gene programs;Hsp70.3 and cardioprotection after late ischemic preconditioning〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2010;49(4)：664-72.

7 Porto I，Leone AM，Crea F，et al.Inflammation，genetics，and ischemic heart disease：focus on the major histocompatibility complex(MHC)genes〔J〕.Cytokine，2005;29(5)：187-96.

8 Ridker PM，Hennekens CH，Buring JE，et al.C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women〔J〕.N Engl J Med，2000;342(12)：836-43.

9 Liu J，Cheng J，Peng J，et al.Effects of polymorphisms of heat shock protein 70 gene on ischemic stroke，and interaction with smoking in China〔J〕.Clin Chim Acta，2007;384(1)：64-8.10 Zee RY，Bates D，Ridker PM.A prospective evaluation of the heat shock protein 70 gene polymorphisms and the risk of stroke〔J〕.Thromb Haemost，2002;87(4)：622-5.

R587.1

A

1005-9202(2012)17-3628-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.005

云南省科技廳-昆明醫學院應用基礎研究聯合專項基金資助課題(2007C0041R);2007年昆明市衛生局課題

金醒昉(1962-)，女，主任醫師，碩士，碩士生導師，主要從事老年病學研究。

魏云鴻(1981-)，女，碩士，住院醫師，主要從事老年病學研究。

〔2011-11-03收稿 2012-02-12修回〕

(編輯 曹夢園)