老年性骨質(zhì)疏松患者血清細胞因子水平與OPG/RANKL/RANK軸的相關(guān)性

鄭 青 梁 寧 (?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗科，海南 海口 570208)

老年性骨質(zhì)疏松患者血清細胞因子水平與OPG/RANKL/RANK軸的相關(guān)性

鄭 青 梁 寧 (?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗科，海南 海口 570208)

目的 通過觀察老年性骨質(zhì)疏松(OP)患者血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、γ干擾素(IFN-γ)、骨保護素(OPG)等細胞因子水平，探討細胞因子在老年性O(shè)P防治過程中的臨床價值。方法 抽取年齡大于70歲的老年患者106例，掃描骨密度(BMD)，根據(jù)Tscore值，分為OP組(n=92)和骨量減少組(n=14)。另選年齡35～47歲健康成人30例為對照組。采用RIA法測定TNF-α，ELISA 法測定 IL-6、M-CSF、IFN-γ、OPG 水平。結(jié)果 老年性 OP 組與骨量減少組，TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ 水平明顯高于對照組，OP 組又明顯高于骨量減少組;OPG水亦明顯高于對照組，但OP組卻顯著低于骨量減少組。結(jié)論 不同濃度細胞因子水平，可直接間接或通過OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)對破骨細胞進行調(diào)節(jié)，與老年性O(shè)P的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

老年性骨質(zhì)疏松;腫瘤壞死因子α;白細胞介素6;巨噬細胞集落刺激因子;γ干擾素;骨保護素

老年性骨質(zhì)疏松(OP)是與年齡相關(guān)的骨丟失，為低轉(zhuǎn)換型，骨吸收與骨形成均不活躍，但仍以骨吸收為主。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的在破骨細胞分化過程中的一個重要信號傳導通路，是成骨細胞作用于破骨細胞的重要途徑。近期研究表明體內(nèi)細胞因子通過影響骨髓微環(huán)境內(nèi)的OPG/RANKL比率來調(diào)節(jié)骨代謝〔1〕。本組通過研究TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ、OPG在老年性O(shè)P患者體內(nèi)的含量變化，進一步深入探討細胞因子、OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)與老年性O(shè)P三者的關(guān)系，為老年性O(shè)P的防治提供更新更好的途徑。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 抽取2002年2月至2010年10月我院老年科門診及住院病人106例，年齡70～85歲，平均(76.82±10.08)歲，其中男56例，女50例。測定骨密度(BMD)，Tscore值低于正常1～2個標準差者為骨量減少組(n=14)，平均年齡(73.52±9.23)歲;Tscore值低于正常2.5個標準差者為OP組(n=92)，平均年齡(76.54±11.23)歲，兩組在年齡上無顯著差異(P＞0.05)。另選我院體檢中心健康成人30例為對照組，年齡35～47歲，平均(41.25±5.23)歲。所有受檢者均排除過胖或病理性肥胖、營養(yǎng)不良，無其他內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤、肝腎病變，未接受激素治療，女性排除絕經(jīng)后OP患者。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有受檢者均清晨空腹采血，2 h內(nèi)分離血清，-20℃保存待檢。

1.2.2 血清TNF-α測定 放射免疫分析法。試劑盒由中國同位素公司北方免疫試劑研究所提供，嚴格按說明書操作。

1.2.3 血清 IL-6、M-CSF、IFN-γ、OPG水平測定 ELISA 法。IL-6由深圳晶美生物技術(shù)有限公司提供。M-CSF由上海瑞晶公司提供。IFN-γ試劑盒為北京晶美有限公司產(chǎn)品。OPG試劑盒由武漢博士德公司提供。所有操作均嚴格按說明書進行。

1.2.4 BMD檢測 應(yīng)用FT-647型骨礦含量測定儀，測定非優(yōu)前臂中、遠1/3交界處橈骨BMD。

2 結(jié)果

三組檢測結(jié)果見表1。老年患者 TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ水平與年齡呈正相關(guān)(r=0.389、r=0.408、r=0.523、r=0.468)與 BMD 呈負相關(guān)(r=-0.441、r=-0.436、r=-0.508、r=-0.397)，OPG水平與年齡呈正相關(guān)(r=0.320)。老年OP組與骨量減少組，TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ 水平明顯高于對照組(P＜0.01，P＜0.05)，而OP組亦明顯高于骨量減少組(P＜0.05)。OPG水平顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，而OP組卻明顯低于骨量減少組(P＜0.05)。

表1 各組血清 TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ、OPG 水平(±s)

表1 各組血清 TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ、OPG 水平(±s)

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P＜0.01

指標 n TNF-α(μg/L) IL-6(pg/ml) M-CSF(pg/ml) IFN-γ(pg/ml) OPG(pg/ml) BMD(g/cm2)對照組 30 0.92±0.25 8.20±3.80 228.49±37.54 56.80±11.71 227.24±96.38 0.783±0.049骨量減少組 14 1.05±0.311) 11.40±2.101) 319.68±42.111) 70.68±9.821) 473.4±110.802) 0.662±0.0761)OP組 92 2.20±0.372) 15.36±2.812) 470.58±45.752) 86.75±10.332) 361.4±100.81) 0.570±0.0482)

3 討論

骨在整個生命過程中都在不斷的重建，即破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨的過程，二者緊密偶聯(lián)，正常情況下呈動態(tài)平衡。隨著年齡老化，骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞轉(zhuǎn)化，成骨細胞前體細胞分化減少，導致成骨細胞功能下降，呈現(xiàn)成纖維細胞的重分化狀態(tài)，而此時破骨細胞的凋亡相對減少〔2〕且在多種細胞因子的刺激下，破骨細胞功能及轉(zhuǎn)化率相對增加，從而導致兩類細胞間失偶聯(lián)，引起OP。近期研究表明，體內(nèi)細胞因子通過影響骨髓微環(huán)境內(nèi)的OPG/RANKL比率來調(diào)節(jié)骨代謝〔1〕。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的在破骨細胞分化過程中的一個重要信號傳導通路，其主要機制是：①成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表面表達RANKL，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結(jié)合后促進破骨細胞的分化，從而引起骨溶解。②成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞分泌表達 OPG，與RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合，或與RANKL/RANK結(jié)合體結(jié)合成三聚體，直接抑制RANKL/RANK的作用，從而抑制骨溶解的產(chǎn)生〔3〕。經(jīng)離體實驗顯示，OPG可提高骨密度，增加小梁骨量，減少破骨細胞數(shù)，控制鈣的吸收，還可以通過抑制破骨細胞f-肌動蛋白環(huán)形成抑制骨吸收或干擾基質(zhì)細胞與破骨細胞之間的相互作用，誘導破骨細胞凋亡〔4〕。OPG還是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRALL)等腫瘤壞死家族成員的假受體，可抑制TRALL所誘導的細胞凋亡，從而在心血管系統(tǒng)疾病中起作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)：OPG水平與年齡呈正相關(guān)。可能的原因是：①循環(huán)中OPG濃度反映年齡相關(guān)因素;②機體對過量骨吸收的一種生理反應(yīng)或補償反應(yīng);③血清OPG水平可能同時也反映進行性血管疾病，且隨心血管危險性增加而增加。我們還發(fā)現(xiàn)，在無年齡差異的老年患者群，OP組OPG水平顯著低于骨量減少組，提示OPG缺乏與老年性O(shè)P的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

TNF-α是一種非常重要的炎性因子，它具有多種生物學功能，包括調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、凋亡和抗病毒反應(yīng)等。在骨骼系統(tǒng)中，TNF-α通過多種途徑致OP，能夠抑制細胞外基質(zhì)沉積并刺激基質(zhì)金屬蛋白酶的合成，從而降解有機骨質(zhì);而且它還可以促進溶骨性細胞因子如M-CSF和RANKL的表達，從而刺激破骨細胞的產(chǎn)生。有實驗發(fā)現(xiàn)，缺乏TNF相關(guān)活化誘導細胞因子(TRANCE)或它的受體RANK的鼠患有嚴重骨病，在他們的骨內(nèi)檢測不到破骨細胞〔5〕。但 Kobayashi等〔6〕和 Kudo等〔7〕先后報道了TNF-α體外可直接誘導老鼠和人的破骨細胞分化為具有骨吸收活性的破骨細胞，不依賴于RANKL/RANK途徑。同時，在破骨細胞前體細胞中TNF-α可以通過增加cfms在脊髓前體細胞表面的表達來調(diào)節(jié)骨髓中破骨細胞前體細胞的充裕量，而c-fms的表達產(chǎn)物是M-CSF的受體〔8〕。而MCSF又是使RANK在破骨細胞前體細胞中得到表達的刺激因子。

IL-6是一種多功能的細胞因子。在體內(nèi)由成骨細胞、基質(zhì)細胞、B細胞等多種細胞分泌，具有廣泛生物學功能，主要在急性炎癥反應(yīng)過程中作為中介，介導B細胞的增殖與成熟。正常情況下，IL-6基因表達受嚴密調(diào)控，因此，在循環(huán)中幾乎檢測不出，隨著年齡增長，這種嚴密調(diào)控逐漸放松，即使在無炎癥刺激下也可檢出。我們的研究證實，IL-6與年齡呈正相關(guān)。在OP中，IL-6作為自分泌旁分泌因子在骨吸收中起作用。它可以通過RANKL依賴的機制調(diào)節(jié)破骨細胞前體細胞向破骨細胞的分化，也可以直接刺激骨內(nèi)RANKL和OPGmRNA的表達及增加前列腺素合成的量〔9〕。還可刺激粒-巨噬細胞集落形成單位(CFU-GM)的發(fā)育，并促進破骨母細胞的形成。IL-6還可通過多種途徑對成骨細胞的增殖分化和凋亡起調(diào)節(jié)作用。

M-CSF 能誘導破骨細胞增殖〔10〕。Haynes等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，在單核細胞和成骨細胞的體外共同培養(yǎng)系中，伴隨著破骨細胞的形成，出現(xiàn)M-CSF高表達。Fujikaw等〔11〕在體外對人的破骨細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)M-CSF在0～100 ng/ml能誘導破骨細胞形成和增殖，并呈濃度依賴方式。我們的實驗結(jié)果亦證實，老年性O(shè)P患者，M-CSF水平明顯高于同齡骨量減少組與對照組。M-CSF還可增強成熟破骨細胞的活性，例如伸展、運動、黏附以及細胞骨架的形成〔12〕，這些功能的發(fā)揮依賴M-CSF與其受體c-fms的集合。M-CSF還可調(diào)節(jié)成熟破骨細胞的吸收和遷移功能，Lees等〔13〕發(fā)現(xiàn)，M-CSF通過增強破骨細胞的體積來增加破骨細胞的骨吸收活性。M-CSF能抑制破骨細胞的凋亡，延長其存活，其抑制破骨細胞凋亡的途徑是通過蛋白激酶B(PKB)介導的。在OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)中，M-CSF與RANKL對破骨細胞的分化成熟有協(xié)同作用，RANK可調(diào)控破骨細胞祖細胞和鈣離子的代謝，其配體RANKL通過誘導Cathepsin K基因的表達而具有誘導破骨細胞從破骨祖細胞的分化功能，M-CSF誘導類多核樣巨噬細胞，二者共同促進巨噬細胞成為破骨細胞〔14〕。

IFN-γ可通過RANKL-RANKs信號傳導抑制破骨細胞形成，然而Gao等〔15〕已經(jīng)證實：雖然在體外IFN-γ可以通過抑制破骨細胞的分化來發(fā)揮其抗破骨細胞形態(tài)的活性，但在活體內(nèi)IFN-γ是破骨細胞形成的潛在刺激劑，它可以上調(diào)組織相容性復合體Ⅱ類抗原(MHC-Ⅱ)的表達，進而促進T細胞的活化與增殖。而活化的T細胞可以產(chǎn)生大量的RANKL和TNF-α等。在活體內(nèi)，IFN-γ這種間接的促進作用已遠遠超過其對破骨細胞前體的抑制作用，最終導致破骨細胞的形成，誘發(fā)OP。

本實驗證明，TNF-α、IL-6、M-CSF、IFN-γ、OPG 水平在骨代謝方面是十分重要的細胞因子，與老年性O(shè)P的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。深入研究細胞因子及OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)二者的關(guān)系，可為老年性O(shè)P的防治提供更新更好的途徑。

1 Hofbauer LC，Kuhne CA，Viereck V.The system in metabolic bone diseases〔J〕.J Musculoskel Neuron Interact，2004;4(3)：268-75.

2 曹建中，劉福成，張雪松，等.老年骨內(nèi)科疾病學〔M〕.北京：中國科學技術(shù)出版社，1998：11-3.

3 Hsu H，Lacey DL，Dunstan CR，et al.Tumor necrosis receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003;96(7)：3540-5.

4 Lacey DL，Tan HL，Lu J，et al.Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast surival in vitro and vivo〔J〕.Am J Pathol，2006;157(20)：435-48.

5 Kim N，Kadono Y，Takami M，et al.Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis〔J〕.Exp Med，2005;202(4)：589-95.

6 Kobayashi K，Takahashi N，Jimi E，et al.Tumor necrosis factors alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL RANk interaction〔J〕.J Exp Med，2000;191(2)：275-76.

7 Kudo O，F(xiàn)ujikawa Y，Itonaga I，et al.Proinflammatory cytokine(TNF α/IL 1 α)induction of human osteoclast formation〔J〕.J Pathol，2002;198(2)：220-7.

8 Yao Z，Li P，Zhang Q，et al.Tumor necrosis factor-α increases circulating osteoclast precursor numbers by promoting their proliferation and defferentiation in the bone marrow through up-regulation of c-fms expression〔J〕.J Biol Chem，2008;28(12)：11846-55.

9 Liu XH，Kinchenbaum A，Yao S，et al.Cross-talk between the interleukin-6 and prostaglandin E(2)signaling system results in enhancement of osteoclastogenesis through effects on the osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-κB(RANK)ligand RANK system〔J〕.Endocrinology，2005;146(8)：1991-8.

10 Haynes DR，Crotti TN，Zreiqat H.Regulation of osteoclast activity in peri-implant tissues〔J〕.Biomaterials，2004;25(20)：4877-85.

11 Fujikawa Y，Sabokbar A，Neale SD，et al.The effect of macrophage-cology stimulating factor and other humoral factors(interleukin-1，-3，-6，and-11，tumor necrosis factor-alpha，and granulocyte macrophage-colony stimulating factor)on human osteoclast formation from circulating cells〔J〕.Bone，2001;28(3)：261-7.

12 Hodge JM，Kirkland MA，Nicholson GC.Multiple roles of M-csf in human osteoclastogenesis〔J〕.Cell Biochem，2007;102(3)：759-68.

13 Lees RL，Heersche JN.Macrophage colony stimulating factor increases bone resorption in dispersed osteoclast cultures by increasing osteoclast size〔J〕.Bone Miner Res，1999;14(6)：937-45.

14 Stejskal D，Bartek J，Pastorkova R，et al.Osteoprotegerin，RANK，RANKL〔J〕.Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olo-monc Czech Repwb，2001;145(2)：61-4.

15 Gao Y，Grassi F，Ryan MR，et al.IFN-γ stimulates osteoclast formation and bone loss in vivo via antigen-driven T cell activation〔J〕.J Clin Invest，2007;117(1)：122-32.

R681.1

A

1005-9202(2012)17-3651-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.015

鄭 青(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事免疫學研究。

〔2011-04-08收稿 2011-10-12修回〕

(編輯 曹夢園)