快速測定紅曲中γ-氨基丁酸含量的薄層色譜-比色法研究

李 利

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

陳 莎

(長江大學(xué)圖書館，湖北 荊州 434025)

趙 穎，陳福生

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

快速測定紅曲中γ-氨基丁酸含量的薄層色譜-比色法研究

李 利

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

陳 莎

(長江大學(xué)圖書館，湖北 荊州 434025)

趙 穎，陳福生

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

通過對紅曲中γ-氨基丁酸(GABA)的提取方法、薄層色譜(TLC)展開劑及其顯色斑洗脫液的比色法測定波長及范圍的研究，建立了一種簡便、快速測定紅曲中GABA含量的方法。結(jié)果表明，紅曲中GABA最佳提取方法為水提法，TLC分離的最佳展開劑為95%乙醇︰25%氨水=4︰1，GABA顯色斑洗脫液的最大吸收波長為512nm，在2～10μg范圍內(nèi)GABA的含量同洗脫液光密度的線性關(guān)系良好(R2=0.9983)。此方法對紅曲樣品中GABA的測定結(jié)果與高效液相色譜法一致性好，回收率為91.00%～96.33%，適合于大批量菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中GABA含量的定量分析。

紅曲；γ-氨基丁酸；薄層色譜；分光光度法

紅曲亦名丹曲，是以大米為原料，經(jīng)紅曲菌(Monascusspp.)發(fā)酵而成的米曲。紅曲在我國的應(yīng)用至今已有一千多年的歷史，它廣泛用于釀酒、食品著色、發(fā)酵及中藥等方面[1]。

γ-氨基丁酸(GABA)被認(rèn)為是紅曲中降壓的主要成分[2-4]。研究證明，GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是一種生理活性物質(zhì)，能夠降低血壓、促使精神安定、促進(jìn)腦部血流、增進(jìn)腦活力、改善腦機(jī)能、增加生長激素分泌，以及改善更年期綜合癥等[3,5-6]。

由于GABA對于電化學(xué)和紫外、可見光等不靈敏，因此，對其進(jìn)行直接檢測存在一定困難。目前，國內(nèi)外報(bào)道的GABA檢測方法有高效液相色譜法[5,7]、毛細(xì)管電泳法[8]、放射受體法[9]、酶法[10]、紙層析法[11]等，但這些方法大多價(jià)格昂貴，多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本研究針對紅曲中的GABA含量的測定，建立了一種簡便、低廉、快速測定食品中GABA含量的TLC-比色法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

紅曲米為自制，具體方法參照文獻(xiàn)[12]。將制備好的紅曲米在45℃下烘干至恒重，粉碎過40目篩備用。

展開劑1：V(正丁醇)︰V(冰醋酸)︰V(水)=4︰1︰1；展開劑2：V(正丁醇)︰V(冰醋酸)︰V(水)=4︰1︰3；展開劑3：V(95%乙醇)︰V(氨水)=9︰1；展開劑4：V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1。

顯色劑為0.2%茚三酮乙醇溶液。洗脫劑采用75%乙醇︰30g/L CuSO4溶液=15︰1。

主要儀器有YUKO-TF薄層涂敷器、島津UV-1700型紫外可見光譜儀和島津SPD 10AVP型高效液相色譜儀等。

1.2 方法

1.2.1 提取方法的比較試驗(yàn)

根據(jù)馬莉鋒等[5]報(bào)道的紅曲中GABA提取方法，參考國內(nèi)關(guān)于紅芪、米胚芽等GABA的提取方法[11,13-14]，設(shè)計(jì)以下2種提取方案。

(1)水提取法 準(zhǔn)確稱取紅曲粉2.00g置于50ml離心管中，加15ml蒸餾水，混勻，30℃下150r/min搖床振搖過夜，5000r/min離心，取上清用20ml氯仿分2次萃取，合并水層，40℃水浴濃縮至干，加2ml蒸餾水溶解備用。

(2)乙醇提取法 準(zhǔn)確稱取紅曲粉2.00g置于50ml離心管中，加15ml 60%乙醇，混勻，30℃下150r/min搖床振搖過夜，5000r/min離心，取上清40℃水浴濃縮至干，加2ml蒸餾水溶解備用。

1.2.2 薄層色譜分離時(shí)展開劑的選擇試驗(yàn)

硅膠H與0.7%的羧甲基纖維素鈉按1︰3(W︰V)的比例調(diào)成糊狀，用涂敷器鋪成0.5mm厚的層析板(10cm×13cm)，自然干燥后于105℃活化30min，放于干燥器中待用。

將GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液以點(diǎn)狀或線狀點(diǎn)樣于硅膠H層析板，分別使用上述4種展開劑展開，展距10cm。隨后置層析板于通風(fēng)櫥中吹干，然后以0.2%茚三酮乙醇溶液噴霧，90℃顯色10min。其中選用含氨水的展開劑3和4時(shí)，在通風(fēng)櫥中吹干后需要進(jìn)一步于90℃烘箱保溫30min以揮盡氨氣，避免層析板上殘余的氨與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)后形成紅色的背景干擾色。

1.2.3 比色分析時(shí)波長的選擇試驗(yàn)

將GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液以線狀點(diǎn)樣于層析板，按1.2.2的方法用V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1為展開劑展開并顯色，用薄塑料片刮下顯色帶處的硅膠，收集后置于10ml離心管中，加1.6ml洗脫液進(jìn)行洗脫，5000r/min離心10min，上清用200μl微量比色皿(光程L=1cm)在480～600nm進(jìn)行掃描，測定吸收曲線，根據(jù)最大吸收峰的位置確定測定波長。

1.2.4 測定范圍的確定

取5～70μl 0.2μg/μl的GABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每10μl在硅膠H層析板上點(diǎn)成1cm長的線狀點(diǎn)樣帶，按1.2.3的方法展開、顯色并洗脫，測定顯色帶洗脫上清液的光密度D512nm，得到GABA含量與光密度D512nm之間的關(guān)系，根據(jù)線性范圍確定方法的測定范圍。

1.2.5 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2.00g紅曲粉置于50ml離心管中，一組加入GABA標(biāo)準(zhǔn)品600μg (加標(biāo)量300μg/g)，另一組不加GABA標(biāo)準(zhǔn)品，每組設(shè)置3個(gè)平行，按1.2.1的水提法進(jìn)行提取，提取液按1.2.3的方法展開、顯色、洗脫并測定洗脫上清液的光密度D512nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GABA含量。依據(jù)加標(biāo)量、加標(biāo)準(zhǔn)品和未加標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果，計(jì)算方法的回收率。

1.2.6 精確度試驗(yàn)

選取2個(gè)GABA含量不同的紅曲樣品，分別采用TLC-比色法和HPLC法測定其GABA含量，通過比較TLC-比色法與反相高效液相色譜法的測定結(jié)果，計(jì)算TLC-比色法的精確度。

GABA的反相高效液相色譜測定參考文獻(xiàn)[7]。樣品提取液用0.1mol/l碳酸鉀緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，0.22μm微孔濾膜過濾。每1ml過濾后的樣品稀釋液加入500μl OPA衍生液進(jìn)行衍生。色譜條件: 色譜柱為Kromasil C18(5μm,250.0mm× 4.6mm) ; 流動(dòng)相為磷酸鉀緩沖液( 0.1mol/l，pH6.0)∶甲醇∶乙腈體積比為6∶3∶1; 檢測器為熒光檢測器，熒光激發(fā)波長Ex = 340nm，發(fā)射波長Em = 455nm; 流速0.6ml/min；進(jìn)樣量20μl。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

采用醇提法和水提法分別對紅曲中GABA進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，乙醇提取液中紅色色素含量較高，呈深紅色(表1)。由于薄層色譜分析時(shí)，GABA等氨基酸用茚三酮溶液噴霧顯色后亦呈紅色，故隨展開劑展開的紅色色素對GABA的顯色斑有較嚴(yán)重地干擾。相比之下，水提法色素干擾較少，TLC分離時(shí)氨基酸的顯色斑清晰，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用水提法提取紅曲中的GABA。

表1 2種提取方法比較

2.2 展開劑的選擇

關(guān)于層析法分離分析氨基酸，不同文獻(xiàn)使用不同的展開劑和配比。張暉等[11]用紙層析分析米胚芽中GABA含量時(shí)，比較了幾種展開劑配方，發(fā)現(xiàn)展開劑V(正丁醇)︰V(冰醋酸)︰V(水)=4︰1︰3能夠很好地將米胚芽提取物中的GABA同其他氨基酸分開。本研究中發(fā)現(xiàn)不同配比的正丁醇-冰醋酸-水展開劑對紅曲提取液中氨基酸的分離效果很差，展開后的氨基酸顯色斑連成一片，GABA無法同其他氨基酸分開，可能是紅曲中氨基酸組成和含量與米胚芽中存在較大差異所致。因此，進(jìn)一步研究了不同配比的乙醇-氨水展開劑的分離效果，發(fā)現(xiàn)展開劑V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1能很好地將提取液中GABA與其它氨基酸分開。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用展開劑V(95%乙醇)︰V(25%氨水)=4︰1。

2.3 測定波長的選擇

圖1 GABA顯色斑洗脫液吸收曲線

將在硅膠H層析板上收集的GABA顯色帶采用洗脫液進(jìn)行洗脫后，上清在480～600nm進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)GABA顯色帶洗脫液在512nm處有最大吸收峰(圖1)，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中GABA洗脫液的光密度均在512nm處測定。

圖2 GABA含量與洗脫液光密度D512nm的關(guān)系

2.4 測定范圍的確定

取1、2、4、6、8、10、12、14μg GABA標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣于硅膠H層析板，展開后顯色并測定顯色帶洗脫上清液的光密度D512nm，得到GABA含量與光密度D512nm之間的關(guān)系(圖2)。由圖2可知，當(dāng)點(diǎn)樣量在10μg內(nèi)時(shí)，D512nm與GABA的含量呈線性關(guān)系，其中在2～10μg范圍內(nèi)，GABA的含量與D512nm之間線性關(guān)系良好，以D512nm(Y)對GABA質(zhì)量(X)進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=0.0439X+0.1219，R2= 0.9983。

2.5 方法的回收率

選取2個(gè)GABA含量不同的紅曲樣品，按1.2.5的方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，該方法的回收率在91.00%～96.33%之間，平均值為93.50%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.03%。

2.6 方法的精確度

選取2個(gè)GABA含量不同的紅曲樣品，分別采用TLC-比色法和HPLC法測定其GABA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法測定結(jié)果一致性較好，TLC-比色法的測定值約為HPLC測定值的92.45%(表3)，可見TLC-比色法有較好的精確度，可用于紅曲中GABA的定量分析。

3 討論與小結(jié)

GABA是一種具有生理活性的氨基酸。近年來，GABA在保健食品中的應(yīng)用研究逐漸興起，選育高產(chǎn)GABA的微生物及其發(fā)酵條件的優(yōu)化是其重要研究方向之一[2,7,15-17]。氨基酸自動(dòng)分析儀、高效液相色譜儀等現(xiàn)代分析儀器可以快速準(zhǔn)確地測定GABA的含量，但由于菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化的研究中需要測定的樣品多、工作量大，而且容易受研究經(jīng)費(fèi)、設(shè)備條件等因素限制，所以此類方法難以在一般的實(shí)驗(yàn)室普及。因此，建立一種簡便、快速準(zhǔn)確、能大批量測定樣品中GABA的方法意義重大。

紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物紅曲的成分比較復(fù)雜，色素含量高，氨基酸種類也較多，GABA的提取和分析難度較大。本研究采用水浸提法提取紅曲中的GABA，能有效避免醇溶性紅曲色素的干擾，再采用氯仿萃取法除去部分水溶性色素，最終的提取液色素含量少，TLC分離時(shí)氨基酸的顯色斑清晰。為了簡便、快速地測定紅曲提取液中GABA含量，本研究將TLC和分光光度法相結(jié)合，先采用TLC分離樣品中的GABA，經(jīng)茚三酮顯色得到穩(wěn)定的紅色色斑，這樣一方面可以直接根據(jù)顯色斑的大小和顏色深淺進(jìn)行定性和半定量分析，另一方面可收集GABA顯色斑進(jìn)行洗脫，通過比色法測定洗脫液的光密度進(jìn)行定量分析。

表2 TlC-比色法測定GABA的回收率

表3 TLC-比色法與HPLC的測定結(jié)果比較

本研究結(jié)果表明，采用TLC-比色法定量測定GABA含量時(shí)，最佳展開劑為95%乙醇︰25%氨水=4︰1，測定波長為512nm，線性范圍為2～10μg，方法的回收率在91.00%～96.33%之間，其測定結(jié)果與HPLC測定結(jié)果相比精確度達(dá)92.45%。該方法適合于大批量菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中GABA含量的定量分析。

[1]Li L,Shao Y,Li Q,et al.Identification ofMga1,a G-protein α-subunit gene involved in regulating citrinin and pigment production inMonascusruberM7[J].FEMS Microbiology Letters,2010,308: 108-114.

[2]Su Y C,Wang J J,Lin T T,et al.Production of the secondary metabolites γ-aminobutyric acid and monacolin K byMonascus[J].Microbial Biotechnol,2001,30: 41-46.

[3]Lee B H,Pan T M.Benefit ofMonascus-fermented products for hypertension prevention: a review[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,94: 1151-1161.

[4]Kohama K,Matsumoto S,Mimura T,et al.Isolation and identification of hypotensive principles in red-mold rice[J].Chem Pharm Bul1,1987,35: 2484-2489.

[5]馬莉鋒，周立平，孫佰申，等．HPlC-ElSD法定量分析紅曲霉發(fā)酵樣品中的γ-氨基丁酸[J]．釀酒科技，2004,(6): 88-89.

[6]Okada T,Sugishita T,Murakami T,et al.Effect of defatted rice germ enriched with GABA for sleeplessness,depression,autonomic disorder by oral administration[J].Nippon Shokuhin Kagaku Kashi,2000,47:596-603.

[7]李 利，陳福生．紅曲菌GABA高產(chǎn)菌株的篩選及培養(yǎng)基的研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,40(30): 14956-14957.

[8]朱 珠．遞質(zhì)氨基酸的毛細(xì)管電泳一安培檢測[J]．分析測試學(xué)報(bào)，1999,18(4): 36-38.

[9]Nahorski S R．A radioreceptor assay using3H-muscimol for GABA in Human CSF[J]．Br J Pharmaca1,1981,72: 16-19.

[10]胡紅焱，楊樹德．細(xì)菌熒光法酶生物發(fā)光分析法測定血清氨基丁酸[J]．臨床檢驗(yàn)雜志， l998,16(2): 67-69.

[11]張 暉，徐 永，姚惠源．紙層析法定量測定米胚芽中的γ-氨基丁酸[J]．無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,23(2): 101-103.

[12]胡曉清，陳福生，邢淑婕，等．紅曲中桔霉素的薄層層析分析[J].食品科學(xué)，2003,24(5): 126-129.

[13]邵 晶，郭 玫，余曉輝，等．雙波長薄層掃描法測定復(fù)方紅芪顆粒劑中γ-氨基丁酸的含量[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，2004,11(7): 610-611.

[14]周立紅，胡根勇．紅芪及其顆粒劑中γ-氨基丁酸的含量測定[J]．中草藥，1995,26(17): 518-521.

[15]吳 非，邊 鑫，李 良，等．高產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的篩選及誘變育種研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,(5): 6-10.

[16]Wang J J,lee C L,Pan T M.Improvement of monacolin K,γ-aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of environmental conditions ofMonascuspurpureusNTU 601[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2003,30: 669-676.

[17]Li H,Qiu T,Huang G,et al.Production of γ-aminobutyric acid byLactobacillusbrevisNCl912 using fed-batch fermentation[J].Microb Cell Fact,2010,9: 85-92.

2012-11-22

李 利(1983-)，湖北浠水人，博士，講師，主要從事微生物學(xué)的教學(xué)與研究。

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.12.008

TS201.2

A

1673-1409(2012)12-S023-04