氯化甲基汞和甲氨蝶呤對Jurkat細胞凋亡的影響

趙玲玲，李小翠，劉秀花，畢曉穎，李志超，袁長吉＊

（1.吉林大學白求恩第一醫院腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學公共衛生學院，吉林 長春130021）

MMC為烷基汞化合物，具有良好的脂溶性，極易透過血腦屏障；能夠誘導自由基的產生、改變細胞內Ca2＋環境、影響蛋白質的磷酸化、干擾線粒體功能以及DNA的復治［1］，具有多靶點細胞毒效應，促進腫瘤細胞凋亡。考慮MMC理化結構特點以及多靶點抗腫瘤效應，研究者提出MMC治療白血病的新策略。臨床上常應用高劑量甲氨蝶呤（High－dosemethotrexate，HDMTX）治療急性淋巴細胞白血病［2］（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）。本實驗選擇MTX作為陽性對照，通過體外細胞實驗研究MMC誘導Jurkat細胞凋亡的情況，有望為白血病的治療提供一種新的化療藥物。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Jurkat細胞（吉林大學第一醫院腫瘤中心凍存）；RPMI1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（美國 Gibco公司）；MTT（北京鼎國生物技術有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinⅤ－FITC／PI凋亡試劑盒（碧云天生物技術研究所）；酶標儀（美國Bio－Rad Model 550）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 細胞培養 Jurkat細胞，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養。每2－3天換液傳代1次，傳至2－3代后取對數生長期細胞用于本實驗。

1.3 MTT比色法檢測MMC和MTX對Jurkat細胞增殖的抑制率 分別取對數期生長期Jurkat細胞，進行細胞計數調整細胞密度為1×105個·mL－1，每孔90μl接種于96孔板中。分別取1.25、2.5、5、10和20μmol·L－1的 MMC或 MTX 10μl加入到對數期生長的Jurkat細胞中，設3個平行復孔。藥物作用24小時后，顯微鏡下觀察細胞生長狀態。每孔加入 MTT 20μl，37℃，5%CO2培養4小時，1 000r·min－1離心5min，棄上清，每孔加入DMSO 150μl，充分混勻后用用酶標儀570nm測定各孔吸光度值（A值），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率＝（1－（實驗組A值－調零孔A值）／（對照組A值－調零孔A值））×100%。

1.4 細胞凋亡率檢測 分組同上，常規收集細胞，應用2.50、5.00、10.00和20.00μmol·L－1MMC和MTX作用24h，細胞計數調整至1×105個·mL－1，各取1ml，1000r·min－1離心5min，棄上清，加入195μl Annexin V－FITC結合液輕輕重懸細胞；加入5μl Annexin V－FITC，混勻后室溫避光孵育10分鐘；1 000r·min－1離心5min，棄上清，加入190μl Annexin V－FITC結合液輕輕重懸細胞；加入10μl PI染色液，混勻后進行流式細胞儀檢測。

1.5 統計學分析 細胞增殖抑制率以±s表示，采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 MMC和MTX對Jurkat細胞增殖抑制作用MTT結果顯示不同劑量的MMC和MTX作用Jurkat細胞24h，隨著劑量的增加，其對細胞增殖的抑制率逐漸上升，呈現明顯的劑量依賴性。在10 μmol·L－1藥物濃度下，MMC組較MTX組細胞增殖抑制率明顯增加，兩組差異比較有統計學意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 不同藥物對Jurkat細胞增殖抑制率（24h，n＝3，±s，η／%）

表1 不同藥物對Jurkat細胞增殖抑制率（24h，n＝3，±s，η／%）

＊ 與MTX組對比P＜0.05

MMC／MTX（μmol·L－1）rates MMC group MTX group Inhibitory 1.25 11.42±1.22 6.72±1.37 2.50 13.90±1.28 11.73±1.22 5.00 17.51±1.21 14.36±1.95 10.00 65.52±2.99 34.62±2.53 20.00 89.16±2.55 42.83±3.25

2.2 MMC和MTX對Jurkat細胞凋亡的影響 應用AnnexinⅤ／PI雙染法進行流式細胞學檢測，結果顯示，對照組凋亡率（0.15±0.03）%，10μmol·L－1的MMC和MTX誘導Jurkat細胞的凋亡率分別為（54.65±3.15）%，（26.32±2.64）%；實驗組較對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），且MMC組與 MTX組相比較差異有顯著性（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 不同藥物誘導Jurkat細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果

3 討論

本實驗結果顯示，不同濃度MMC和MTX均可抑制Jurkat細胞增殖，且抑制率與濃度正相關；Jurkat細胞接觸10μmol·L－1的 MMC凋亡率開始明顯增加，且與同濃度MTX作用相比較差異有顯著性。可見MMC有促進白血病細胞凋亡的作用，與MTX相比其誘導凋亡作用更為顯著。

ALL是兒童惡性腫瘤中最常見的疾病，占小兒惡性腫瘤的50%左右［3］。因其極易發生神經系統浸潤，死亡率較高。因此尋找一種新的能夠有效誘導腫瘤細胞凋亡并容易透過血腦屏障的藥物是目前淋巴細胞白血病治療亟待解決的問題。臨床上常用甲氨蝶呤進行治療，使用常規劑量的MTX很難通過人體內的“血腦屏障”，“血睪屏障”等，極易導致中樞浸潤或疾病復發。HDMTX能夠透過上述屏障，達到治療的目的。但是隨著藥物劑量的加大其毒副作用也隨之增加，臨床上很多病人往往很難承受化療藥物帶來的這一不良作用［4，5］。MMC屬于烷基汞化合物，具有良好的脂溶性，極易透過血腦屏障。具有多靶點細胞毒效應，可引起DNA斷裂，其烷基結構能與DNA堿基相互作用形成雙鏈內及鏈間交聯，影響 DNA 復制［6］，誘導自由基的生成［7］；同時影響細胞內Ca2＋環境，升高細胞內 Ca2＋負載［8］；并影響線粒體膜電位，改變其膜通透性，使細胞色素C釋放至胞漿并與Apaf－1結合，引起Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡［1］。本實驗證實 MMC能夠有效誘導Jurkat細胞凋亡，且較MTX作用顯著；同時MMC為脂溶性化合物，極易透過血腦屏障，能夠起到預防和治療中樞神經系統白血病的作用。有望為白血病的臨床治療提供一種新的化療藥物。

MMC對各種蛋白質和氨基酸的巰基有極高的親和力。而調控細胞凋亡和增殖的許多酶都含有巰基，巰基是其作用的觸發器，MMC與巰基結合后可干擾酶的活性，并影響線粒體的功能，影響細胞呼吸和氧化磷酸化過程，繼而發生一系列抗癌的分子生物學事件［9，10］。MMC抑制Jurkat細胞的增殖，促進其凋亡可能與上述機制存在密切的關聯。我們會在后續的實驗中進一步驗證其誘導細胞凋亡的確切機制。

［1］Ou YC，Thompson SA，Kirchner SC，et al.Induction of growth arrest and DNA damage－inducible genes Gadd45and Gadd153in primary rodent embryonic cells following exposure to methylmercury［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1997，147（1）：31.

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［3］張 顏，何明生.急性淋巴細胞白血病靶向基因治療的研究進展［J］.當代醫學，2010，16（2）：36－6，47.

［4］Sukhotnik I，Shteinberg D，Ben LS，et al.Effect of transforming growth factor－alpha on enterocyte apoptosis is correlated with EGF receptor expression along the villus－crypt axis during methotrexate－induced intestinal mucositis in a rat［J］.Apoptosis，2008，13（11）：1344.

［5］Stewart DJ.Tumor and host factors that may limit efficacy of chemotherapy in non－small cell and small cell lung cancer［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2010.

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