胃旁路術對非肥胖2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的影響

鞠振煜，張明威，曲日初，朱寶平，張 偉，田曉豐

（吉林大學普通外科疾病診療中心、吉林大學第二醫院普通外科，吉林 長春130041）

20世紀80年代減肥醫師發現用于減重手術的胃旁路手術（Gastric bypass，GBP）可以使伴Ⅱ型糖尿病的肥胖患者在減重的同時，可以使糖尿病癥狀完全緩解。近年來，胃腸道重建的GBP手術治療2型糖尿病的研究已成為國內外研究的熱點，但其作用機制尚不完全清楚。本研究旨在建立自發性2型糖尿病大鼠GBP手術模型，探索GBP術對胰島β細胞凋亡的影響，為GBP術治療非肥胖2型糖尿病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和動物分組

實驗用8周齡GK大鼠由中科院上海實驗動物中心上海斯萊克實驗動物有限公司提供。動物自由攝取凈水，食物為添加高蛋白的含油脂飼料。大鼠在適應環境后，測量體重、空腹、餐后血糖，胰島素。72只大鼠隨機分為4組：手術組（O組）、假手術組（S組）、飲食控制組（F組）和對照組（C組）。原裝進口凋亡檢測試劑盒購于美國Promega公司。強生穩步血糖測定儀。

1.2 模型制作

O組術前將大鼠禁食12h，將每只大鼠按照50 mg／kg腹腔內注射濃度為0.5%的戊巴比妥鈉，待麻藥生效后，與上腹正中作長約4cm的切口，切斷幽門，縫合十二指腸殘端，在距treitz韌帶約10cm處切斷空腸，幽門斷端與遠端空腸行端端吻合，在距離胃腸吻合口約12cm處行空腸端側吻合，均采用0／7號無創傷棉綸線間斷縫合，縫合系膜裂孔。術中保留了胃的原容積，平均手術時間為1h。S組：用上述同樣方法對大鼠進行麻醉，采取離斷胃竇十二指腸后再原位吻合，并保證相同的麻醉時間。術終均用慶大霉素（96萬U）2ml沖洗腹腔后關腹，術后麻醉醒后自由進水，24h后自由進食。F組，控制每只大鼠進食量15g／d，保證充足飲水。O、F、C組均自由進食，保證充足飲水。

1.3 實驗方法

術前、術后第1、2、4、8周5個時間點，大鼠禁食過夜，剪尾法取血0.5ml后，灌服葡萄糖（2.5g／kg），30min后再取血0.7ml，血樣分別立即加入裝有DPPIV inhibitor10μL的試管中，混勻，靜置30 min后4 000rpm離心10min，分離血清，用于測定血糖、胰島素。術后2w、4w、8w測餐后血糖取血后，分批隨機處死大鼠，每批每組處死6只，大鼠處死后分離胰腺并取出。濾紙吸干水份后沿胰腺縱軸切開，一部分置于10%多聚甲醛中固定待用。血糖測定：取血后使用強生穩步血糖儀測定血糖。胰島素測定：采用放射免疫法測定，雙管法，取兩次測定的平均值。TUNEL法檢測胰島β細胞凋亡。

1.4 統計學方法

實驗數據計量資料采用均數±標準差表示。不同組之間的同一時間點指標采用獨立樣本的t檢驗，單個指標手術前后的變化采用配對t檢驗，采用SPSS13.0for Windows統計學軟件進行統計。

2 結果

2.1 血糖

O組GΒP術后第1周空腹血糖已開始下降，術后第4周空腹血糖由術前的16.21±0.76mmol／L下降到9.18±0.61mmol／L，差異具有統計學意義（P＜0.01）；至術后第8周血糖維持在9.65±0.66 mmol／L，與術前、術后2周比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）。術后第4周餐后血糖由術前的31.06±1.10mmol／L下降到13.11±0.71mmol／L，差異具有統計學意義（P＜0.01）；至術后第8周下降到12.32±0.66mmol／L，與術前、術后2周比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；O組術后第4、8周空腹、餐后血糖與同時間其他各組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；F組在控制飲食1周后空腹血糖也出現下降，第4周、第8周由15.84±114mmol／L 分別下降到11.65±0.63mmol／L、12.00±0.58mmol／L，差異具有統計學意義（P＜0.01）；S組、C組實驗過程中后空腹血糖無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05）

2.2 胰島素

O組術后第4周起空腹血清胰島素水平由術前27.95±1.16mIU／L升高到62.82±1.87mIU／L，術后第8周為61.64±1.35mIU／L，與本組術前、術后2周比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；均明顯高于相同時間點的其他各組，差異有統計學意義（P＜0.01）；O組術后第4、8周餐后血清胰島素水平分別為77.43±1.05mIU／L、77.07±0.96 mIU／L，與本組術前、術后2周比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；明顯高于相同時間的其他各組，差異具有統計學意義（P＜0.0l）；F組、S組、C組實驗過程中空腹及餐后血清胰島素水平無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05）

2.3 胰島β細胞凋亡水平改變

O組大鼠胰島隨著術后時間的延長，凋亡細胞數逐漸減少，至術后4周下降至5.92±0.74%，至術后8周凋亡細胞百分比為6.33±1.08%，細胞凋亡率明顯低于同時間其他各組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與術后2周比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；O組術后第8周細胞凋亡率略高于第4周，差異無統計學意義（P＞0.05）（表3、圖9－16）。

表1 各組大鼠血糖變化（mmol／L，±s）

表1 各組大鼠血糖變化（mmol／L，±s）

△ ：與同時間其他各組比較，P＜0.01；★：與同組術前，術后1、2W 比較，P＜0.01

組別 術前 術后1周 術后2周 術后4周 術后8周O組空腹 16.21±0.76 14.08±0.65△ 13.09±0.61△ 9.18±0.61△★ 9.65±0.66△★餐后 31.06±1.10 29.25±1.19△ 26.48±0.76△ 13.11±0.71△★ 12.32±0.66△★S組空腹 15.88±1.03 16.10±1.01 15.56±0.86 16.13±0.62 16.35±0.60餐后 31.32±1.44 30.39±1.56 31.35±1.27 31.03±0.93 31.66±1.17 F組空腹 15.84±1.14 15.53±0.92 13.11±0.66 11.65±0.63 12.00±0.58餐后 30.20±1.31 29.48±1.04 26.78±0.82 24.55±0.74 23.38±0.69 C組空腹 15.82±0.84 15.93±0.78 15.79±0.76 15.99±0.74 16.29±0.60餐后 30.93±1.35 30.19±1.42 30.81±0.78 31.07±1.13 30.96±0.85

表2 各組大鼠血清胰島素濃度變化（mIU／L，±s）

表2 各組大鼠血清胰島素濃度變化（mIU／L，±s）

△：與同時間其他各組比較，P＜0.01；★：與同組術前、術后1、2W 比較，P＜0.01。

組別 術前 術后1周 術后2周 術后4周 術后8周O組空腹 27.95±1.16 29.09±0.96△ 31.33±1.08△ 62.82±1.87△★ 61.64±1.35△★餐后 31.41±0.75 32.60±0.72△ 34.74±0.93△ 77.43±1.05△★ 77.07±0.96△★S組空腹 27.52±1.12 27.46±1.06 27.08±0.78 26.85±0.77 26.85±1.01餐后 31.49±0.90 32.13±0.88 31.26±0.86 31.19±1.21 31.26±1.19 F組空 腹 27.90±1.23 27.30±1.06 28.72±1.02 30.72±1.09 30.17±0.88餐后 31.37±0.79 32.38±0.75 32.60±0.70 33.63±0.86 33.22±0.73 C 組空腹 27.44±1.23 27.40±0.83 26.96±0.81 26.77±0.83 26.57±0.96餐后 31.05±0.79 31.24±0.92 30.64±0.95 30.71±1.24 30.40±1.53

表3 術后各組大鼠胰島凋亡細胞數及凋亡細胞百分比（%，±s）

表3 術后各組大鼠胰島凋亡細胞數及凋亡細胞百分比（%，±s）

△ ：與同時間其他各組相比P＜0.01；★：與術后2W相比，P＜0.01

組別 術后2w 術后4w 術后8w凋亡細胞數 百分比O組 18.67±2.25△ 9.33±1.13△ 11.83±1.47△★ 5.92±0.74△★ 12.67±2.16△★ 6.33±1.08凋亡細胞數 百分比 凋亡細胞數 百分比△★S組 93.33±1.86 46.67±0.93 94.33±1.97 47.17±0.98 94.33±2.07 47.17±1.03 F 組 48.67±2.58 24.33±1.29 42.17±2.32 21.08±1.16 42.33±2.42 21.17±1.21 C 組 92.50±2.88 46.25±1.44 93.00±3.29 46.50±1.44 92.00±2.83 46.00±1.41

3 討論

GBP術后第4、8周空腹及餐后血糖明顯下降，表明GBP對非肥胖2型糖尿病大鼠的糖代謝具有良好的改善作用。GBP對2型糖尿病大鼠的糖代謝改善作用的機制可能與減少胰島素抵抗和改善胰島功能有關［1］。本研究顯示，GBP術后第4、8周空腹及餐后 胰島素水平 升高。表明GBP手術可改善胰島β細胞功能，在治療2型糖尿病中起著重要的作用。

20世紀80年代便有資料表明2型糖尿病患者胰島β細胞的數量明顯下降［4］。事實上，最近一些通過研究手術后的胰腺標本證實在2型糖尿病發病機制中，胰島β細胞數量的減少和功能的下降起到了重要的作用［2，3］。英國前瞻性糖尿病研究（UKPDS）顯示，2型糖尿病患者無論是否接受強化治療，隨著病程的延長，最終將因胰島β細胞功能受損導致血糖控制上的惡化。引起胰島細胞功能障礙的原因比較復雜，細胞凋亡是2型糖尿病胰島β細胞數量減少的主要原因，凋亡引起的胰島β細胞數量減少足以致高血糖。從上世紀90年代至今的十幾年間，大量的動物學實驗和人體尸檢研究顯示胰島β細胞的高水平凋亡在糖尿病發生前就已存在，糖尿病發生后，凋亡水平進一步增高。胰島β細胞的凋亡可能是導致2型糖尿病發生、發展的一個重要因素，這些細胞的衰竭最終導致機體血糖的升高和2型糖尿病的發生［5］。凋亡的增多或減少都會導致特定疾病的病理生理過程，尤其是細胞凋亡增多，是導致細胞數量減少和功能下降的重要原因。在2型糖尿病，有多種因素可誘導胰島β細胞凋亡，從而導致胰島功能受損。文獻報道，成年高血糖GK大鼠胰島β細胞數量下降達60%［6］。本研究結果顯示，經過GBP術干預的糖尿病鼠的胰島β細胞凋亡水平在術后2、4、8W均顯著低于對照組，并有統計學意義（P＜0.01），從而證實GBP術的確能夠有效降低胰島β細胞凋亡水平。GBP術對糖尿病的控制作用，可能就與其抑制β細胞凋亡，從而有效地保護胰島細胞功能和延緩胰島細胞功能障礙進展有關。

［1］DeFronzo RA.Pharmacologic therapy for type 2diabetes mellitus［J］.Ann Intern Med，1999，131：281.

［2］Butler A E，Janson J，Bonner－Weir S，et al.Betacell deficit and increased beta－cell apoptosis in humans with type 2diabetes［J］.Diabetes，2003，52：102.

［3］Yoon K H，Ko S H，Cho J H，et al.Selective beta－cell loss and alpha－cell expansion in patients with type 2diabetes mellitus in Korea［J］.J Clin Endocrinol，2003，8：2300.

［4］Hellerstrom C.The life story of the pancreatic beta cell［J］.Diabetologia，1984，26：393.

［5］White S，Brooks E，Jurikova L，et al.Long－term outcomes after gastric bypass［J］.Obes Surg，2005，15：155.

［6］Portha B，Giroix M－H，Serradas P P，et al.Beta－cell function and viability in the spontaneously diabetic GK rat.Information fromthe GK／Par colony［J］.Diabetes，2001，50：89.