超聲滅活后的國人成骨肉瘤細(xì)胞（OS－732）的超微結(jié)構(gòu)變化

潘雪峰，徐長妍，孫新立，葛付濤，牛 豐＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 脊柱外科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 病案室）

隨著針對骨肉瘤基礎(chǔ)研究的深入和保肢手術(shù)治療的開展，有效滅活骨肉瘤組織成為手術(shù)當(dāng)中最為關(guān)鍵的一環(huán)，它直接關(guān)系到術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及生存率的問題。我們采用超聲滅活成骨肉瘤細(xì)胞（OS－732），觀察滅活后細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞成活率，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 ①成骨肉瘤細(xì)胞（OS－732），購于北京積水潭醫(yī)院。②超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY92－Ⅱ?qū)幉ㄐ轮タ破餮芯克?輸出功率：0－1000W）。③MTT溶液。④透射電子顯微鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 OS－732細(xì)胞長滿單層并處于指數(shù)生長期時消化并進(jìn)行收集分組實(shí)驗(yàn)。對照組：未采取任何方法處理。超聲滅活組：即采用超聲滅活的細(xì)胞組。①光鏡觀察：收集約1×105個細(xì)胞，離心后棄上清并用超聲滅活，然后用加樣器將細(xì)胞團(tuán)吹碎涂于載玻片上，HE染色，在光鏡下觀察并攝片。②電鏡觀察：收集約5×108個腫瘤細(xì)胞，離心后超聲滅活。第一組超聲滅活的定時次數(shù)為75次；第二組超聲滅活的定時次數(shù)為150次。工作時間2s，間歇時間2s，輸出功率為400W。加入2.5%戊二醛固定。制作超薄切片后在透射電鏡下觀察。③MTT比色法測定對照組和滅活組細(xì)胞活性。

2 結(jié) 果

2.1 對照組細(xì)胞形態(tài) 光鏡下細(xì)胞主要為多邊形、三角形。胞漿輕度嗜堿性，細(xì)胞核較大、深染、異形性明顯。核染色質(zhì)較粗，核仁大，核仁1－5個，可見病理分裂相。透射電鏡下可分為電子密度較高的“暗細(xì)胞”（圖1.A）和中等電子密度的“亮細(xì)胞”（圖1.B）兩種類型。細(xì)胞核大且不規(guī)則；核染色質(zhì)分布均勻；核仁大，有時可見雙核仁；胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和較發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及大量分泌泡；線粒體數(shù)量較少；還可見多量核糖體及少量溶酶體。細(xì)胞表面有非常發(fā)達(dá)的微絨毛［1］。

2.2 超聲滅活組細(xì)胞形態(tài)

光鏡下HE染色后觀察，同對照組相比，鏡下含有兩種主要成分，一種為有形成分，主要以腫瘤細(xì)胞為主，可見到未被超聲擊碎的比較完整的腫瘤細(xì)胞，同對照組中的腫瘤細(xì)胞無顯著差異。還可見到細(xì)胞膜被超聲擊碎的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核脫離細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，游離在鏡下。另一種為無形成分，為被超聲擊碎的細(xì)胞碎片，無任何結(jié)構(gòu)及形態(tài)，無法辨認(rèn)其原始結(jié)構(gòu)。

Fig.1 Ultrastructure features of OS－732cells under normal culture conditions.Cell structure，such as nucleus，chromosome and double pathological nuclears can be cleary seen

透射電鏡觀察表明，經(jīng)75次超聲滅活后，細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)同對照組相比出現(xiàn)明顯差異。經(jīng)75次超聲作用后，可見鏡下含有兩種主要成分，一種為有形成分，主要以腫瘤細(xì)胞為主，可見到未被超聲擊碎的比較完整的腫瘤細(xì)胞，同對照組中的腫瘤細(xì)胞無顯著差異。胞核內(nèi)可見到正常的核仁、核染色質(zhì)，核膜無明顯變化，胞漿內(nèi)可見到正常的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基氏復(fù)合體、線粒體、核糖體、溶酶體、分泌泡等細(xì)胞器成分。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)無顯著變化。還可見到細(xì)胞膜被超聲擊碎的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核脫離細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，游離在鏡下，其結(jié)構(gòu)同對照組的細(xì)胞核相比無明顯差異。另外還可見到正常的細(xì)胞器成分因細(xì)胞膜破裂而游離在鏡下，其結(jié)構(gòu)同對照組的細(xì)胞器相比無明顯差異。另一種為無形成分，為被超聲擊碎的細(xì)胞碎片，無任何結(jié)構(gòu)及形態(tài)，散在于細(xì)胞間，無法辨認(rèn)其原始結(jié)構(gòu)。擊碎的細(xì)胞已無法保存其內(nèi)環(huán)境，從而導(dǎo)致不可逆性損傷。（圖2.A，圖2.B）

Fig.2 Ultrastructure features of OS－732cells treated by ultrasound 75periods.Broken cells and fragment can be seen compared with contrast cells

光鏡下HE染色后觀察，同對照組相比，鏡下主要為無形成分，無法找到具有細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，均為被超聲擊碎的細(xì)胞碎片，無任何結(jié)構(gòu)及形態(tài)，無法辨認(rèn)其原始結(jié)構(gòu)和來源，同75次超聲滅活組中的無形成分相一致。

透射電鏡觀察表明，經(jīng)150次超聲滅活后，細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)同對照組和其它滅活組相比出現(xiàn)明顯差異。經(jīng)150次超聲作用后，鏡下全部為無形成分，無法找到具有細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器成分，均為被超聲擊碎的細(xì)胞碎片，無任何結(jié)構(gòu)及形態(tài)，無法辨認(rèn)其原始結(jié)構(gòu)和來源，同75次超聲滅活組中的無形成分相一致。細(xì)胞已形成不可逆性損傷［1］。（圖3.A，圖3.B）

Fig.3 Ultrastructure features of OS－732cells treated by ultrasound 150periods.Only cell fragments can be seen compared with contrast cells

2.3 MTT比色法 沒有檢測到滅活后培養(yǎng)細(xì)胞的A值，證明骨肉瘤細(xì)胞已經(jīng)有效地被滅活。

3 討論

超聲屬于熱滅活腫瘤的一種方法，被認(rèn)為是最有希望的治療腫瘤的新方法之一［2，3］。采用超聲治療腫瘤的理論基礎(chǔ)之一是認(rèn)為某些腫瘤較正常細(xì)胞對超聲更加敏感。在體和離體的實(shí)驗(yàn)均表明，超聲可以殺滅腫瘤細(xì)胞，破壞腫瘤組織，抑制腫瘤組織增殖［2］。特別是近年來以HIFU為代表的高強(qiáng)度聚焦超聲（High Intensity Focused Ultrasound，HIFU）治療體內(nèi)癌腫裝置的改進(jìn)和對其生物學(xué)效應(yīng)研究的深入，被認(rèn)為是超聲治療腫瘤的趨勢。

3.1 超聲滅活骨肉瘤細(xì)胞（OS－732）的形態(tài)學(xué)改變的分析 經(jīng)超聲處理后的OS－732，光鏡和透射電鏡下觀察，主要含有兩種成分，一種為有形成分，主要以腫瘤細(xì)胞為主，可見到未被超聲擊碎的比較完整的腫瘤細(xì)胞。還可見到被超聲擊碎的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞核脫離細(xì)胞，游離在鏡下。另一種為無形成分，為被超聲擊碎的細(xì)胞碎片，無任何結(jié)構(gòu)及形態(tài)，無法辨認(rèn)其原始結(jié)構(gòu)。75次超聲滅活組中兩種成份均可見到，而150次超聲滅活組中則以無形成分為主，無法找到有形成分，經(jīng)MTT法檢測細(xì)胞無任何活性。這充分說明這兩種方法能夠有效地對骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行滅活，特別是150次超聲滅活后細(xì)胞被完全擊碎，能夠更徹底地將腫瘤細(xì)胞殺滅。

3.2 超聲滅活腫瘤機(jī)理的探討 通過本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲能夠有效地將腫瘤細(xì)胞擊碎，故對其抗癌機(jī)制的探討和闡明十分必要。

①熱效應(yīng) 一般認(rèn)為熱機(jī)制在超聲治療腫瘤中起主要作用。雖然組織內(nèi)溫度上升受多種因素影響，但卻與組織吸收能量成正比，當(dāng)組織溫度升至50－60℃時，由于蛋白質(zhì)變性，可致生物組織明顯變化，表現(xiàn)為凝固性壞死［2－5］。在 HIFU 治療時，焦域內(nèi)溫度幾秒內(nèi)即可達(dá)100℃，而43℃以上足可以致腫瘤細(xì)胞不可逆性損傷。

②空化效應(yīng) 空化作用可致生物組織內(nèi)自由基產(chǎn)生而損壞生物組織，經(jīng)超聲沖擊波和空化聯(lián)合作用之細(xì)胞增殖能力、DNA合成能力均明顯低于正常對照組［6］，甚至是細(xì)胞被完全擊碎，完全找不到正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)而無任何細(xì)胞生物功能。因此，空化效應(yīng)是超聲致死腫瘤過程中又一起主要作用的因素。

③對化學(xué)治療的增強(qiáng)作用 化療仍是目前惡性腫瘤治療的重要手段，提高化療效果和降低其副反應(yīng)是許多研究想要解決的問題［7－11］。腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的聚集是較為重要的因素之一。細(xì)胞膜通透性的增加有助于藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，超聲處理能夠通過壓力波使膜通透性增強(qiáng)，使一些大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞漿［12］。超聲的焦點(diǎn)處即有這種壓力，起到這種作用［7］。膜通透性增加的原因還可能與空化效應(yīng)對細(xì)胞膜的損傷有關(guān)，特別是使用頻率較低超聲波時，更易產(chǎn)生空化作用［13］。腫瘤組織DNA修復(fù)能力增強(qiáng)是其耐藥機(jī)制之一［14］。在研究超聲對腫瘤細(xì)胞DNA合成時的影響時發(fā)現(xiàn)，0.5w／cm2和1w／cm2能抑制Ehrlich腹水瘤細(xì)胞DNA的合成，而0.1w／cm2則能夠刺激DNA的合成，但它對DNA的修復(fù)合成（Unschedulated DNA Synthesis）并無明顯影響［15］。此既提示采用超聲治療腫瘤需足夠的強(qiáng)度，也提示超聲治癌并不誘使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對化療的多藥耐藥性。

④免疫機(jī)制 此機(jī)制尚不明確，也正是超聲治療學(xué)中亟待闡明的問題。有學(xué)者認(rèn)為是由于高溫固化留置瘤苗的作用，一方面，超聲破壞癌腫，使瘤／宿主優(yōu)勢得以改善，另一方面，高溫使癌組織變性，腫瘤組織抗原性改變，更易刺激機(jī)體免疫。腫瘤局部熱療與免疫關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，高熱可促進(jìn)腫瘤組織合成熱休克蛋白（HSP），HSP可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫功能［16］。

與此同時，經(jīng)微波滅活后的保肢術(shù)能夠保留關(guān)節(jié)的正常功能，術(shù)中減少血行播散和局部擴(kuò)散，提高患者的免疫功能，從而提高了患者的生存率和生活質(zhì)量，是目前很好的治療骨腫瘤的方法。

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