基質金屬蛋白酶－9聯合尿脫落細胞FISH檢測診斷膀胱癌的價值

韓 永，徐燕杰，黃海燕，許曉光，蔡 明，石炳毅

（解放軍第309醫院全軍器官移植中心研究室，北京100091）

膀胱移行上皮細胞癌（transitional cell carcinoma of bladder，TCCB）是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，早期治療愈后佳，5年生存率可達80%，晚期治療療效差，5年生存率僅50%［1］。膀胱鏡檢查及細胞形態學檢測是最常用的診斷TCCB的方法，但細胞形態學檢測敏感性低，膀胱鏡檢查因痛苦患者難以接受［1］。檢測尿液中與膀胱癌發生相關的抗原診斷TCCB敏感性較低，易漏診。應用尿脫落細胞熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）檢測3、7、9、17號染色體數目畸變診斷TCCB敏感度高、特異性強，且無創性，尤其對早期TCCB患者有輔助診斷作用，對TCCB的診斷具有重要價值［2－3］。

基質金屬基質蛋白酶（matrix metallo－proteinases，MMPs）是人體內降解細胞外基質（extracellular marix，ECM）的主要酶類，而ECM 在腫瘤的侵襲和浸潤過程中發揮重要的作用。MMP－9是MMPs家族中的重要成員之一，與多種腫瘤的惡性生物學表現以及預后密切相關［4，5］。本研究通過對100例TCCB患者及20例健康體檢者采用EL ISA法檢測血清MMP－9含量，同時聯合熒光原位雜交技術檢測尿脫落細胞，探討二項聯合檢測診TCCB癌的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月－2008年4月在解放軍總醫院第二附屬醫院器官移植中心泌尿外科住院TCCB患者100例（膀胱癌組），診斷均經手術病理證實。男81例，女19例；年齡20－60歲，中位年齡52歲。腫瘤臨床病理分級：T1－T2 47例，T3－T4 53例。對照組20例，男15例，女15例；年齡20－60歲，2組性別、年齡比較差異有無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 MMP－9檢測 應用ELISA法，試劑盒購自美國ROCHE公司，按說明書進行操作。TCCB組于手術前檢測。

1.2.2 FISH 采用多中心，雙盲研究比較FISH和尿細胞學檢查診斷肉眼和鏡下血尿患者患TCCB的敏感性。血尿經過證實后，尿液標本被送往中心單位實驗室，患者行膀胱鏡檢，膀胱鏡下的可疑病變均取活檢或者切除，病理標本診斷并分期分級（圖1，圖2）。熒光原位雜交（FISH），探針標記P16，3、7、17號染色體著絲粒試劑盒均購自北京金菩嘉醫療科技有限公司產品，－20℃保存備用。3、17號染色體著絲粒探針為綠色熒光信號，7號染色體著絲粒探針和雜交到9號染色體長臂（9q21）的P16探針為桔紅色熒光信號。

收集受檢者新鮮尿液后分為2份，1份按照試劑盒說明書方法進行FISH實驗操作，另1份離心涂片（離心半徑10cm，離心時間10分鐘，2 500r／min），HE染色尋找腫瘤細胞。

間期FISH步驟：取出儲存于－20℃的離心涂片標本，具體步驟參照試劑說明書，具體見文獻［9］；

通過FISH點計數分析2.0軟件控制的冷電荷耦合設備相機攝取圖像，OLYMPUS BX51熒光顯微鏡，每組探針分析100－200個細胞。

1.3 結果判定 單體：單個信號的核比例＞15%；3倍體及多倍體：3個及多個信號的核比例＞10%細胞總數。組合探針（P16，3、7，17）陽性判定依據UroVysion推薦標準［7］：至少在4個細胞中同時存在3、7、17號染色體中的2個染色體的擴增，或至少在12個細胞中存在9p21純合性缺失。尿脫落細胞學以發現腫瘤細胞為陽性，未發現腫瘤細胞為陰性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以均數標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組血清MMP－9水平比較 TCCB組與正常組比較，血清中 MMP－9水平明顯升高（P＜0.001），相關性分析結果，年齡、性別、腫瘤類型因素與TCCB MMP－9陽性表達無明顯相關（P＞0.05）。

2.2 2組FISH脫落細胞學檢測結果比較 采集20個健康成人尿液，使用推薦方法制備玻片及進行CSP7／CSP3P16／CSP17的FISH檢測。閾值測定每組探針組合分析200個細胞.統計出現不同異常情況的百分比.閾值＝ 平均數（M ）＋3x標準差（SD）。如果檢測值大于閾值，判定為陽性結果。FISH檢測出現2個紅色信號的間期細胞為98.5%，3個紅色信號的間期細胞數為（0.94±1.2）%。健康成人FISH結果顯示各探針表現為2紅、2綠2個雜交信號（圖3）。在TCCB組，FISH結果可見不同程度的染色體數目異常（見圖4）。對照組FISH及尿脫落細胞學檢測結果均為陰性。TCCB組FISH檢測全部為陽性（見圖4）。TCCBFISH陽性表達相關性分析，年齡，性別，腫瘤類型因素與膀胱癌FISH陽性表達無明顯相關（P＞0.05）。參數病理分級越高，FISH 陽性突變越高，表明TCCBFISH陽性表達呈現規律性量化改變，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 不同病理學分級 膀胱癌患者血清中MMP－9水平比較隨著腫瘤組織學分級增高，膀胱移行細胞癌血清中MMP－9含量依次升高，具有顯著性差異（P＜0.001），見表1。

表1 對照組與不同組織學分級膀胱移行細胞癌血清MMP－9含量比較

2.4 相關分析結果 TCCB組血清MMP－9表達 與年齡，性別，腫瘤類型因素無明顯相關（P＞0.01）。TCCB FISH陽性表達的相關性分析：年齡，性別，腫瘤類型因素與膀胱尿路上皮癌FISH陽性表達無明顯相關（P＞0.05）。病理分級越高，FISH陽性突變越高，說明TCCB患者FISH陽性表達呈現出規律性的量化改變，差異顯著（P＜0.01）（表2）。

3 討論

目前，膀胱鏡組織活檢病理檢查為診斷膀胱癌金標準，尿脫落細胞學、經腹部超聲檢查、尿核基質蛋白－2（NMP－2）、膀胱腫瘤抗原（BTA）及免疫細胞因子（ImmunoCyt）等腫瘤標記物是發現和檢測TCCB的常用方法［6－8］。但膀胱鏡為有創檢查，嚴重時可導致出血、膀胱穿孔等并發癥，患者不易接受，尤其對泌尿系統急性感染期、尿道狹窄、膀胱容量過小、出血性疾病、女性月經期及不能接受膀胱截石體位的患者無法行膀胱鏡檢查。膀胱鏡視野也有一定盲區。尿脫落細胞形態學檢查方法簡單、無創，是診斷和術后隨訪的主要方法。但敏感性相對較低。

圖1 尿路上皮癌Ⅲ級HE（100倍）

圖2 尿路上皮癌Ⅲ級HE（400倍）

圖3 正常人F ISH陰性

圖4 尿路上皮癌FISH陽性

表2 研究組膀胱移行細胞癌FISH陽性表達的相關性分析

隨著對TCCB遺傳學改變的深入研究，人們發現9號染色體部分（如p16位點）或全部丟失是最常見遺傳學改變，且這一改變與TCCB的早期發生密切相關。此外，TCCB的發展與染色體不穩定性也緊密相連，尤其是與3，7號及17號染色體的非整倍性密切相關［1］。對尿液或膀胱沖洗液中細胞進行以上遺傳學改變的檢測對TCCB的早期診斷及病程監測有較大價值，其靈敏度高于細胞形態學檢測，特異性則與細胞形態學檢測相當。Halling等［9］對265例患者在TCCB檢查前檢測上述指標，診斷TCCB的敏感性為81%，特異性為100%。Skacel等［10］報道，對尿脫落細胞學檢查不確定或非典型性改變的標本再行檢測，敏感性可達100%，特異性達89%。因此，對于細胞學檢查不確定的病例，可作為一項檢測手段。而Yoder等［11］研究結果認為，對于尿脫落細胞學檢查診斷模糊或不典型的病例，檢測可以明確TCCB的診斷，無需行膀胱鏡檢查。本研究結果顯示，隨著腫瘤級別的增高，FISH靈敏度也隨之升高。

有研究結果證實［9－11］，使用尿脫落細胞熒光原位雜交技術檢測3、7、9、17號染色體數目畸變診斷膀胱移行細胞癌具有敏感度高、特異性強的優點，并具無創性，尤其對早期尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，對TCCB的診斷具有重要的臨床應用價值。目前FISH技術復雜還不夠成熟，檢測費用亦較高，時間周期長（3－4天），臨床中還未大量開展開展腫瘤的FISH檢測。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要特征，是腫瘤細胞、宿主細胞及細胞外基質（ECM）之間一系列復雜、多步驟相互作用的結果，其中腫瘤細胞與細胞外基質間相互作用在這一過程中起著關鍵作用，而MMPs幾乎降解ECM的所有成分，從而促進癌細胞對周圍正常組織的侵襲，導致腫瘤的擴散和轉移［11］。已有研究結果［12，13］發現，血清中 MMPs及其他細胞因子水平可夠反映組織中的表達情況，通過測定血清中的水平，評價其在腫瘤生長中的作用。本研究通過對血清MMPs水平的測定也證實了上述結果。膀胱移形細胞癌組血清MMP－9水平明顯高于正常對照組。此外發現隨著腫瘤臨床分期的增高，浸潤性膀胱移行細胞癌患者血清中的 MMP－9濃度明顯高于淺表性膀胱腫瘤，分析其可能與浸潤性膀胱腫瘤更易膀胱異位復發有關。本研究還對不同組織學分級的膀胱移形細胞癌患者血清中的MMPs進行測定，發現上述指標隨腫瘤病理學分級的增加而增高。國外研究表明在測定肺癌［14］、乳腺癌［15］患者血清 MMPs含量時，發現隨著腫瘤分期及級別升高，濃度明顯升高，與本研究結果一致。腫瘤組織中均存在MMPs的高表達，由于組織中MMPs的高表達，明膠酶MMPs通過降解毛細血管和淋巴管基底膜，導致腫瘤進入循環中，腫瘤細胞再分泌 MMPs，引起遠處轉移［16－19］。血清中 MMPs高含量可能與膀胱腫瘤的侵襲轉移及高復發率有關，并提示預后不良。綜上所述，MMPs參與了膀胱腫瘤的早期發生、發展，并與腫瘤的浸潤轉移有關，MMPs的血清學檢測，直接反映血清中的濃度，其含量的測定可作為判斷膀胱移形細胞癌預后的重要指標之一。

熒光原位雜交，基質金屬基質蛋白酶水平聯合檢測對膀胱癌的診斷有重要參考價值，彌補了單獨檢測熒光原位雜交的不足。腫瘤標志物聯合檢測的最大意義在于增加腫瘤檢出的線索，為臨床診斷、早期治療提供了重要的參考價值，并可能作為判斷膀胱移形細胞癌預后的重要指標。

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