N-乙酰半胱氨酸對體外循環(huán)致大鼠腦損傷的保護(hù)作用*

曹惠鵑 周 錦 張鐵錚 孫瑩杰 姚 婧

體外循環(huán)（CPB）繼發(fā)腦損傷的原因包括CPB期間的低溫、低灌注狀態(tài)，非搏動血流，炎性介質(zhì)及血管內(nèi)微栓等。這些因素共同作用，促進(jìn)了CPB期間腦缺氧/缺血和全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氧自由基形成過多和抗氧化物質(zhì)的損耗。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是細(xì)胞維持正常生理功能的重要化合物——谷胱甘肽（GSH）的前體物質(zhì)，對氧化應(yīng)激、缺血-再灌注損傷等有一定的防治作用。本研究通過建立大鼠CPB模型，觀察NAC對CPB大鼠血漿腦損傷標(biāo)志物、炎性因子及海馬區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響，探討NAC對CPB致大鼠腦損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 24只健康雄性清潔級SD大鼠，4～6個月齡，體質(zhì)量300～400 g，購自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。按隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組（S組）、CPB組（C組）、CPB+NAC組（N組），每組8只。S組僅置管，不進(jìn)行CPB；C組和N組進(jìn)行CPB 1 h，然后觀察2 h。N組在預(yù)充液中加入NAC（美國Sigma公司，批號A-7250）100 mg/kg，然后以20 mg/（kg·h）速度輸注1 h直到停轉(zhuǎn)流，C組輸注等容量生理鹽水。

1.2 CPB模型建立與標(biāo)本采集 24只大鼠在實驗前禁食水6 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，窺喉后經(jīng)口氣管插管，接TKR200C型呼吸機行機械通氣（江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司），呼吸頻率60次/min，潮氣量10 mL/kg，吸入100%氧氣。四肢連接心電圖導(dǎo)聯(lián)，接多功能監(jiān)測儀（美國太空公司）行心電監(jiān)測，置直腸溫探頭行深部體溫監(jiān)測。左股靜脈建立靜脈通道，微量泵泵注乳酸林格氏液2 mL/h。左股動脈置管監(jiān)測有創(chuàng)動脈壓。靜脈注射肝素300 IU/kg全身肝素化。采用特制帶網(wǎng)狀側(cè)孔16 G穿刺導(dǎo)管置入右頸內(nèi)靜脈至右心房水平，引流靜脈血至貯血槽；右側(cè)頸動脈置24 G套管針，連接動脈灌注管。CPB環(huán)路主要由靜脈引流管、貯血槽、大鼠微型膜氧合器（廣東科威醫(yī)療器械有限公司）、BT00-300M型恒流蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）及動脈灌注管組成。采用無血預(yù)充，預(yù)充液總量約16 mL，由乳酸鈉林格氏液7 mL、琥珀酰明膠7 mL、20%甘露醇1 mL、5%碳酸氫鈉1 mL及肝素鈉150 IU/kg組成。CPB管理參照Cai等[1]介紹的方法。S組于穿刺后3 h，其余組于CPB結(jié)束后2 h取靜脈血3 mL，立即 4 ℃、3 000 r/min、離心5 min，分離血漿，-40℃保存；取大鼠左側(cè)腦組織，-70℃保存；取大鼠左側(cè)半球海馬區(qū)腦組織，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊若干，置入2.5%戊二醛保存。

1.3 檢測指標(biāo) （1）應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法檢測大鼠血漿神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、S-100β蛋白水平（試劑盒購自美國Biokey公司，具體操作按說明書進(jìn)行）。（2）應(yīng)用放射免疫分析法測定大鼠血漿腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）濃度（試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司）。（3）低溫下取腦組織，制備10%的腦組織勻漿，根據(jù)測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書對腦組織勻漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）進(jìn)行測定。（4）將取出的大鼠左側(cè)海馬區(qū)腦組織小塊，置入1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋后切片，鈾、鉛雙染色，置于透射電鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平的變化 與S組比較，C組血漿NSE水平升高（P<0.01），C組和N組血漿S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平均升高（P<0.01）；與C組比較，N組血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01），見表1。

Table 1 Comparison of plasma levels of NSE,S-100β protein,TNF-α and IL-6 between groups表1 各組血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平的比較 （n=8，±s）

Table 1 Comparison of plasma levels of NSE,S-100β protein,TNF-α and IL-6 between groups表1 各組血漿NSE、S-100β蛋白、TNF-α和IL-6水平的比較 （n=8，±s）

*P<0.05，**P<0.01；表2同

組別S組C組N組F q S∶C S∶N C∶N NSE（μg/L）5.30±0.49 8.51±1.02 6.08±0.75 35.74**11.46**2.79 6.09**S-100β（ng/L）0.07±0.06 0.68±0.24 0.33±0.13 42.05**12.95**5.48**7.47**TNF-α（μg/L）0.93±0.17 2.45±0.52 1.73±0.67 17.84**8.46**4.42**4.01*IL-6（ng/L）57.98±9.17 176.06±30.70 98.67±27.49 71.67**16.67**5.74**10.92**

2.2 腦組織MDA和GSH-px含量的變化 與S組比較，C組、N組腦組織MDA含量升高、GSH-px含量降低（P<0.05或P<0.01）；與C組比較，N組腦組織MDA降低、GSH-px含量升高（P<0.01），見表2。

Table 2 Comparison of MDA and GSH-px contents in brain tissue between groups表2 各組腦組織MDA和GSH-px含量的比較 （±s）

Table 2 Comparison of MDA and GSH-px contents in brain tissue between groups表2 各組腦組織MDA和GSH-px含量的比較 （±s）

q1、q2分別為MDA和GSH-px組間兩兩比較結(jié)果

組別 n q1q2 S組C組N組F 8 8 8 MDA（μmol/g）14.06±3.51 68.75±25.63 34.51±16.47 346.71**GSH-px（U/mg）2.82±0.58 2.01±0.36 2.43±0.45 8.36**統(tǒng)計學(xué)處理組比S∶C S∶N C∶N 46.45**13.78**23.15**5.69**3.82*4.11**

2.3 超微結(jié)構(gòu)的改變 S組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，各細(xì)胞器未見異常；C組神經(jīng)元細(xì)胞核變性、壞死，線粒體明顯腫脹、內(nèi)有空泡形成；N組神經(jīng)元內(nèi)線粒體輕微水腫，電鏡結(jié)果見圖1～3。

3 討論

CPB心臟手術(shù)后約有30%的患者產(chǎn)生一定程度的器質(zhì)性或功能性腦損傷，包括認(rèn)知功能障礙，甚至致命性腦中風(fēng)[2]。因此，有效地減少體外循環(huán)后的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是臨床工作中急需解決的問題。目前，在圍CPB過程中應(yīng)用藥物進(jìn)行干預(yù)以減輕CPB后神經(jīng)精神并發(fā)癥是CPB腦保護(hù)策略中重要的一部分。

NAC是廣泛應(yīng)用的抗氧化劑，具有潛在的抗氧化和抗炎作用。NAC通過中和氧自由基、保護(hù)細(xì)胞膜、維持內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)揮保護(hù)作用[3]。研究表明，在損傷后靜脈應(yīng)用NAC能顯著改善缺氧-復(fù)氧新生豬的頸動脈血流和氧供，減少腦皮質(zhì)Caspase-3和脂質(zhì)過氧化物含量的增加[4]。在CPB預(yù)充液中加入NAC，能夠減輕CPB對大鼠的腎損傷，且呈劑量依賴性[5]。而NAC對CPB所誘導(dǎo)的腦損傷是否具有保護(hù)作用，國內(nèi)外罕見報道。心胸手術(shù)過程中應(yīng)用CPB使機體與非生理表面接觸，CPB過程的非搏動血流、低灌注狀態(tài)等可激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)可進(jìn)一步激活炎性反應(yīng)[6]。因此，選用具有抗氧化性質(zhì)的試劑減輕氧化應(yīng)激和氧化應(yīng)激引起的炎性反應(yīng)，以減少CPB后神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，為CPB后腦保護(hù)提供新思路和實驗依據(jù)。

NSE主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，S-100β蛋白濃度特異性地存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、前部垂體細(xì)胞和郎罕細(xì)胞。NSE、S-100β蛋白分子質(zhì)量大，正常情況下不能通過血腦屏障。當(dāng)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷或壞死后，NSE和S-100β蛋白迅速從細(xì)胞內(nèi)溢入腦脊液，通過受損的血腦屏障進(jìn)入血液中，致血漿NSE和S-100β蛋白濃度升高，其含量可反映神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷的程度，對早期直接而準(zhǔn)確地了解腦損傷程度及評價患者的預(yù)后具有重要的臨床意義[7]。本研究表明，CPB使大鼠血漿NSE和S-100β蛋白濃度升高，提示CPB使神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜受損，NSE和S-100β蛋白釋放至細(xì)胞外間隙，通過受損的血腦屏障進(jìn)入血液。NAC可減少大鼠血漿NSE和S-100β蛋白水平的升高，提示其可以減輕CPB所致的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

TNF-α與IL-6是CPB過程產(chǎn)生的促炎因子。TNF-α是引起炎性級聯(lián)反應(yīng)的一個重要而又具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它也是炎性反應(yīng)釋放最早和最重要的內(nèi)源性介質(zhì)。TNF-α可激活中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶和氧自由基等，參與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷，如果釋放到細(xì)胞外，可引起自身組織的破壞。有研究表明，TNF-α在CPB過程中持續(xù)升高，在CPB結(jié)束后2 h達(dá)高峰[8]。IL-6是腦損傷炎癥反應(yīng)鏈中的一種重要炎性細(xì)胞因子，主要通過誘導(dǎo)最初的炎性級聯(lián)反應(yīng)、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮黏附因子表達(dá)、增強興奮性氨基酸毒性作用、降低腦血流、增加血腦屏障通透性等機制在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮作用[9]。基于上述原因，以TNF-α和IL-6作為反映CPB中炎性反應(yīng)的指標(biāo)。本研究表明，CPB使大鼠腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物MDA含量升高、氧自由基清除劑GSH-px含量降低，使血漿TNF-α和IL-6水平均升高，提示CPB可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)。NAC可減少CPB誘導(dǎo)的大鼠腦組織MDA含量的升高及GSH-px含量的降低，可降低血漿TNF-α、IL-6水平的升高，提示NAC可降低CPB所誘發(fā)的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)程度。

海馬區(qū)是大腦對缺血缺氧最敏感的部位之一，本研究的電鏡結(jié)果顯示，CPB可致大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體水腫、核變性，而在CPB期間應(yīng)用NAC可以減輕其病理性損傷。

Figure 1 Computed tomography imaging of tumour in right lobe of liver approach medium-sized vein圖1 CT影像提示肝右葉腫瘤臨近肝中靜脈

Figure 2 Three-dimensional computer reconstruction of the relationship between tumour and medium-sized vein of liver圖2 計算機三維重建顯示腫瘤與肝中靜脈的關(guān)系

Figure 3 Three-dimensional computer reconstruction of the congestion area(blue color)at the left of internal lobe after resection of medium-sized vein圖3 計算機重建切除肝中靜脈后左內(nèi)葉的淤血區(qū)域（藍(lán)色）

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