替米沙坦對胰島素抵抗大鼠冠狀動脈Rho/ROCK信號通路的影響*

丁曉松 李衛萍 沈絮華 武 星 李虹偉

冠心病患者常合并糖代謝異常，糖尿病作為冠心病的等危癥可通過胰島素抵抗、氧化應激等機制引起內皮功能障礙及血管舒縮功能異常[1]。RhoA/ROCK信號通路是近年來研究較多的一個參與血管舒縮功能調節的信號通路。RhoA通過激活ROCK使肌球蛋白輕鏈活化并抑制其失活，導致平滑肌細胞（VSMC）收縮[2]。腎素-血管緊張素系統（RAAS）和Rho/ROCK通路均可通過影響NO合成酶（eNOS）和NO導致血管功能紊亂[3]。有研究顯示具有部分過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ激動作用的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1）阻滯劑替米沙坦能改善糖尿病時血管內皮功能[4]。本文旨在通過觀察替米沙坦對胰島素抵抗大鼠冠狀動脈RhoA及ROCK表達水平的影響，初步探討Rho/ROCK通路是否參與替米沙坦對糖代謝異常時血管內皮功能調節的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠34只，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，于中國醫學科學院藥物研究所動物部進行喂養。尼康SMZ645體視解剖顯微鏡，Mastercycler普通 PCR儀，Gene Amp PCR DG-II暗箱式紫外透箱儀，Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell電泳儀 ，山羊抗大鼠 ROCK1抗體（SANTA，sc-6055），山羊抗大鼠 ROCK2抗體（SANTA，sc-1851），家兔抗大鼠 RhoA 抗體 （Bioworld，BS1782），替米沙坦（Tel）片購于上海勃林格殷格翰藥業有限公司。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購于Invitrogen生物技術有限責任公司。總蛋白提取試劑盒購于ProMab公司，天然膜蛋白抽提試劑盒和天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒購于MERCK公司。

1.2 方法

1.2.1 胰島素抵抗大鼠模型建立 34只大鼠，每籠3只分籠喂養，置于溫度22℃～24℃，濕度60%，每日光照12 h，自由飲水的環境中適應性喂養1周后，隨機抽取24只大鼠予高果糖飼料喂養，高果糖飼料購自中國醫學科學院實驗動物研究所。喂養4周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）25 mg/kg，2周后禁食12 h進行剪尾法采血，測定空腹血糖(FBG)濃度，放射免疫法測定空腹血清胰島素（FSI）濃度，并計算胰島素敏感指數（ISI），ISI=-ln（FBG×FSI），ISI≤ -4.88 說明造模成功。共20只大鼠造模成功，3只造模失敗，1只死亡。將造模成功的20只大鼠隨機分為2組，每組10只，胰島素抵抗（IR）組給予生理鹽水灌胃，替米沙坦干預（Tel）組給予替米沙坦5 mg/（kg·d）灌胃，干預4周，干預結束后分離冠脈進行后續實驗。未造模的10只大鼠為對照組。

1.2.2 測定冠狀動脈組織中RhoA、ROCK1及ROCK2 mRNA表達的水平 干預結束后,無菌條件下取出3組大鼠心臟，在尼康SMZ645體視解剖顯微鏡下迅速分離冠狀動脈放入凍存管中，置于液氮中保存。組織勻漿后按照Trizol試劑說明書提取冠脈組織總RNA，用RT-PCR法分別測定冠狀動脈組織中 RhoA、ROCK1和 ROCK2的 mRNA表達水平。根據GenBank搜索結果以Primer 5.0程序設計引物。RhoA引物序列： 上游 5′-CATCCCAGAAAAGTGGACTCCA-3′， 下游 5′-CCTTGTGTGCTCATCATTCCG-3′， 擴增片段長度 103 bp。ROCK1引物序列：上游5′-GAATGACATGCAAGCGCAAT-3′，下游 5′-GTCCAAAAGTTTTGCACGCA-3′，擴增片段長度 113 bp。ROCK2引物序列： 上游 5′-GAAACAACTGG ATGAAGCTAATGC-3′， 下游 5′-GTTTCAAGCAGGCAGTTTT TATCTT-3′，擴增片段長度150 bp。PCR反應條件95℃50 s，60℃ 60 s，72℃60s，循環45次。

1.2.3 Western blotting測定RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表達水平 采用Total protein Extraction Kit組織裂解提取總蛋白，采用天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtractTM（M-PEK）提取膜蛋白，采用天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒NucBusterTMProtein Exaction Kit提取漿/核蛋白，采用 10%進行 SDSPAGE，山羊抗大鼠 ROCK1 抗體（1∶500），山羊抗大鼠 ROCK2抗體（1∶500）4℃封閉過夜后再與二抗兔抗山羊 IgG/HRP（1∶40 000）孵育 2 h。兔抗大鼠 RhoA 抗體（1∶500）4℃封閉過夜后再與二抗山羊抗小鼠IgG/HRP1∶50 000孵育2 h。免疫印跡用化學發光法顯示，經Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件分別計算RhoA/GAPDH、ROCK1/GAPDH、ROCK2/GAPDH的比值。1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組資料間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組間糖代謝指標比較 與對照組比較，IR組大鼠FBG、FSI均升高，而ISI明顯降低，達到胰島素抵抗水平。Tel組較IR組FBG降低，ISI升高，差異有統計學意義，而FSI無明顯變化，見表1。

Table 1 Comparison of glucose metabolism index between three groups表1 3組間糖代謝指標比較 （n=10，±s）

Table 1 Comparison of glucose metabolism index between three groups表1 3組間糖代謝指標比較 （n=10，±s）

*P<0.05，表2、3同

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2.2 3 組間 RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA 水平的比較 3組大鼠冠狀動脈RhoA和ROCK2 mRNA表達水平接近，差異無統計學意義。IR組大鼠ROCK1 mRNA表達水平較對照組升高，差異有統計學意義（P=0.042）。而其他各組之間ROCK1 mRNA表達水平差異無統計學意義，見表2、圖1。

2.3 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平比較 IR組大鼠RhoA蛋白表達水平較對照組和Tel組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），而Tel組與對照組間RhoA蛋白表達水平差異無統計學意義（P>0.05），見表3、圖2。ROCK1 蛋白表達水平在3組間差異均無統計學意義（P>0.05）。IR組和Tel組ROCK2蛋白表達水平較對照組升高，差異有統計學意義，而IR組和Tel組間ROCK2蛋白表達水平差異無統計學意義，見表3、圖3。

Table 2 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 mRNA expressions between three groups表2 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平比較（n=10，±s）

Table 2 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 mRNA expressions between three groups表2 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA水平比較（n=10，±s）

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Figure 1 RT-PCR detection of ROCK1圖1 ROCK1 RT-PCR結果

Table 3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 protein expressions between three groups表3 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平比較（n=10，±s）

Table 3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK 2 protein expressions between three groups表3 3組間RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達水平比較（n=10，±s）

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Figure 2 Westen blotting detection of RhoA protein expression圖2 RhoA蛋白表達Westen blotting結果

Figure 3 Westen blotting detection of ROCK2 protein expression圖3 ROCK2蛋白表達Westen blotting結果

3 討論

Rho/ROCK信號通路是近些年心血管系統研究的熱點，在冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等疾病發病機制中起到一定作用[2,5]。有研究顯示血管緊張素Ⅱ受體可能參與內皮及血管平滑肌細胞Rho/ROCK信號通路的激活并有可能通過該途徑影響血管舒縮功能[6]。Rho是一種小分子G蛋白，在細胞的信號轉導通路中作為信號轉換器或分子開關，Rho激酶是小G蛋白下游的效應器之一，通過使肌球蛋白輕鏈磷酸化和肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的肌球蛋白結合亞基（myosin binding subunit，MBS）磷酸化，導致平滑肌細胞收縮[5]。Rho/ROCK激酶信號通路可以通過對VSMC的作用介導血管緊張度的改變，調節血管阻力，參與高血壓的發生和發展[7]。自發性高血壓大鼠（SHRs）在高血壓發生之前 Rho激酶的表達和活性都有所提高[8]。ROCK抑制劑Y-27632可降低多種系統性高血壓大鼠模型的全身血壓，但對正常動物的血壓并沒有顯著影響，提示Rho/ROCK通路很大程度上參與了高血壓的發病機制[7]。Y-27632類似物Fasudil的治療效果在給予長期輸入血管緊張素Ⅱ造成的高血壓和冠狀血管病變特征的大鼠模型中也得到證實[2,5]，提示Rho/ROCK信號途徑可能與RASS系統存在相互作用，而血管緊張素受體阻斷劑（ARB）類藥物可能對Rho/ROCK信號途徑具有調節作用。

在VSMC中AngⅡ是通過何種機制導致RhoA活化尚不清楚。Sayk等[9]研究發現在糖尿病發病初期AT1蛋白表達水平即明顯上調。Rho GDI是調節RhoA活性的小分子蛋白，起抑制RhoA活化作用[10]。Bian等[11]分別給予AngⅡ和AT1阻滯劑L158809處理培養的SHR和WKY大鼠主動脈平滑肌細胞后，AngⅡ使SHR大鼠主動脈平滑肌細胞RhoGDIα表達上調，而L158809使其表達下調。據此推測，抑制AT1受體激活可降低RhoGDIα表達，而RhoA表達應上調。本研究發現胰島素抵抗大鼠的冠狀動脈RhoA蛋白表達水平下調與此研究結果一致。給予替米沙坦干預后，胰島素抵抗大鼠冠狀動脈RhoA蛋白表達水平降低被逆轉。

近期的研究顯示ROCK上調在人和動物血管痙攣中發揮重要作用[8]。對心絞痛患者冠脈內使用法舒地爾可以顯著抑制乙酰膽堿誘導的冠脈痙攣及其相關的心肌缺血,提示了Rho激酶很大程度上參與了冠脈痙攣的發病[12]。另外，法舒地爾在微血管心絞痛患者也有一定的治療效果，說明Rho激酶參與介導了冠脈微血管的高反應性[13]。AngⅡ刺激可使人冠狀動脈平滑肌細胞ROCK的功能和表達水平上調[14]。本研究中胰島素抵抗大鼠ROCK1 mRNA表達水平上調，但給予替米沙坦干預后RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平和ROCK1、ROCK2蛋白表達水平與對照組比較差異無統計學意義，與以上研究結果相類似。由于本研究未檢測RhoA和ROCK活性，對其功能變化尚需進一步研究證實。

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