針刺督脈對局灶性腦缺血大鼠腦組織TNF-αmRNA表達的影響*

羅文舒 吳永剛 楊卓欣 于海波 皮 敏 徐紹剛 劉遠聲 潘孝錦

（廣東省深圳市中醫院，廣東 深圳 518033）

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在腦缺血再灌注損傷過程中的作用日益引起人們重視，研究顯示其在炎癥反應和凋亡過程中發揮了關鍵作用［1］。針刺對腦梗死過程中炎性細胞因子的表達和細胞凋亡具有重要調節作用［2］。基于前期研究，本項目擬觀察針刺督脈經穴對腦梗死TNF-α mRNA表達的影響，探索針刺督脈經穴改善腦梗死神經損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 雄性SD大鼠，體質量（200±30）g。隨機分為假手術組、模型組、針刺對照組、針刺督脈組，每組動物隨機分為大腦中動脈栓塞 3、6、12、24、72 h 5 個亞組，每個亞組6 只。

1.2 造模方法 動物以10%水合氯醛腹腔麻醉，參考Kuge［3］造模法，備皮常規消毒，于頸正中切開，分離右側頸總動脈（CCA）、

頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），離斷 ECA的分支，在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線插入ECA內，通過CCA分叉處經ICA插至大腦前動脈（ACA），直至大腦中動脈（MCA）入口處，尼龍線插入深度平均為（18.5±0.5）mm。缺血2 h時向外拉取尼龍線，即可恢復右側MCA血供，形成再灌注。

1.3 針刺治療 針刺對照組和針刺督脈組動物MCAO后即針刺：針刺對照組予針刺氣海、關元（穴位定位參考第1版《實驗針灸學》），持續20 min，每12小時1次；針刺督脈組予針刺百會、風府（穴位定位參考第1版《實驗針灸學》），并予SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀加電，疏密波刺激（疏波5 Hz，密波10 Hz），電壓3～5 V，電流1mA，持續20 min，每12小時1次。假手術組和模型組動物MCAO后即置于針刺操作臺上固定20 min，不作任何治療，每12小時1次。

1.4 標本采集與檢測 大鼠于腦缺血再灌注后 3、6、12、24、72 h后分別麻醉處死。冰上取頂葉皮層，用錫箔紙包好后放入凍存管，立即存于－70℃保存待測。采用RT-PCR檢測TNF-α mRNA。TNF-α 引物序列：上游 5′-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3′，下游 5′-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3′， 擴增產物長度446 bp。內參 β-actin 序列：上游 5′-TGGTACCACTGGCATTGTGA-3′，下游 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，擴增產物長度 545 bp。反應條件：50℃逆轉錄30 min，94℃ 2 min使逆轉錄酶失活，94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，40個循環，72℃延伸10 min，將PCR擴增產物置于2%瓊脂糖凝膠電泳，結果置于凝膠成像分析系統進行吸光度分析，得到TNF-α/β-actin比值，表示TNF-α表達的相對豐度。

1.5 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠觀察期內死亡率分析 假手術組大鼠未出現死亡，其他組大鼠共死亡23只，經χ2檢驗，模型組、針刺對照組、針刺督脈組間動物死亡率無顯著差異（P>0.05）。

2.2 針刺督脈對腦缺血大鼠TNF-α mRNA表達的影響 見表1。實驗結果表明，與假手術組相比，模型組在各觀測點TNF-α mRNA表達水平升高；針刺督脈組與模型組相比，在腦缺血再灌注 12、24 h 和 72 h，TNF-α mRNA 表達水平降低 （P<0.05），與針刺對照組相比，在腦缺血再灌注12 h和24 h，TNF-α mRNA表達水平降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠頂葉皮層TNF-α mRNA表達（n=6，）

表1 各組大鼠頂葉皮層TNF-α mRNA表達（n=6，）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與針刺對照組比較，▲P＜0.05。

組 別 3 h 6 h 12 h 24 h 72 h假手術組 0.263±0.031 0.275±0.028 0.287±0.069 0.264±0.083 0.281±0.056模型組 0.521±0.083*0.864±0.057*1.094±0.143* 1.152±0.149* 0.628±0.087*針刺對照組0.502±0.067 0.816±0.039 0.824±0.041 0.805±0.062△ 0.523±0.049△針刺督脈組0.487±0.058 0.807±0.063 0.665±0.034△▲ 0.716±0.073△▲ 0.504±0.085△

3 討 論

TNF-α主要參與腦梗死早期的炎癥反應，導致神經功能損傷，其與腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）結合，可激活核轉錄因子κB（NF-κB）通路，誘導各種促炎細胞因子（包括 TNF-α）表達，從而上調TNF-α mRNA表達，可見腦梗死早期TNF-α和NF-κB間可相互促進表達，減少存活神經元數量［4］。

中醫學認為腦梗死的病機主要是機體氣血逆亂、腦脈閉阻、陰陽失和。中風急性期應用針灸治療，可行氣血、通經絡、調陰陽，在減輕患者神經系統損傷、促進功能康復等方面發揮了重要作用［5］，在中風病治療方面重視應用督脈和任脈經穴，取得了令人滿意的療效［6］。督脈不僅為陽脈之海，統一身陽氣，領一身氣血，還與諸經交匯，將氣血上輸于腦，以奉元神，故腦脈閉阻不通，可通過調節督脈經氣，以行氣血、通瘀滯、調陽氣。而任脈為陰脈之海，可與督脈共同協調人體陰陽功能。實驗結果表明，針刺督脈治療在腦梗死12、24、72 h時間點可下調TNF-α mRNA的過度表達，提示針刺督脈在缺血性中風急性期的治療中，可能通過調節TNF-α mRNA的表達，減輕炎性反應，減少神經細胞凋亡的發生，從而改善腦缺血再灌注損傷。

［1］Castillo J，Moro MA，Blanco M，et al.The release of tumor necrosis factor-alpha is associated with ischemic tolerance in human stroke［J］.Ann Neurol，2003，54（6）：811.

［2］馬惠芳，林彩霞，任秀君，等.針刺對腦缺血大鼠海馬區凋亡細胞及Caspase-9蛋白表達的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2009，16（11）：25-27.

［3］Kuge Y，Minematsu K，Yamagachi T，et al.Nylon monofilament for in-traluminal middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1995，26（9）：1665.

［4］陳燕啟，劉德紅，楊光田.大鼠急性全腦缺血再灌注時NF-κB表達及意義［J］.臨床醫學研究，2004，21（7）：772-775.

［5］王鵬琴，白麗，蔡虹，等.眼針對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織半暗區Caspase-8、Caspase-3 mRNA表達的影響［J］.針灸臨床雜志，2010，26（9）：51-54.

［6］羅文舒.針灸任督脈治療中風后尿失禁的臨床研究［J］.廣西中醫學院學報，2009，12（1）：12-14.