針刺督脈對局灶性腦缺血大鼠腦組織TNF-αmRNA表達的影響*

羅文舒 吳永剛 楊卓欣 于海波 皮 敏 徐紹剛 劉遠聲 潘孝錦

（廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在腦缺血再灌注損傷過程中的作用日益引起人們重視，研究顯示其在炎癥反應和凋亡過程中發(fā)揮了關鍵作用［1］。針刺對腦梗死過程中炎性細胞因子的表達和細胞凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用［2］。基于前期研究，本項目擬觀察針刺督脈經(jīng)穴對腦梗死TNF-α mRNA表達的影響，探索針刺督脈經(jīng)穴改善腦梗死神經(jīng)損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±30）g。隨機分為假手術組、模型組、針刺對照組、針刺督脈組，每組動物隨機分為大腦中動脈栓塞 3、6、12、24、72 h 5 個亞組，每個亞組6 只。

1.2 造模方法 動物以10%水合氯醛腹腔麻醉，參考Kuge［3］造模法，備皮常規(guī)消毒，于頸正中切開，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、

頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），離斷 ECA的分支，在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線插入ECA內(nèi)，通過CCA分叉處經(jīng)ICA插至大腦前動脈（ACA），直至大腦中動脈（MCA）入口處，尼龍線插入深度平均為（18.5±0.5）mm。缺血2 h時向外拉取尼龍線，即可恢復右側(cè)MCA血供，形成再灌注。

1.3 針刺治療 針刺對照組和針刺督脈組動物MCAO后即針刺：針刺對照組予針刺氣海、關元（穴位定位參考第1版《實驗針灸學》），持續(xù)20 min，每12小時1次；針刺督脈組予針刺百會、風府（穴位定位參考第1版《實驗針灸學》），并予SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀加電，疏密波刺激（疏波5 Hz，密波10 Hz），電壓3～5 V，電流1mA，持續(xù)20 min，每12小時1次。假手術組和模型組動物MCAO后即置于針刺操作臺上固定20 min，不作任何治療，每12小時1次。

1.4 標本采集與檢測 大鼠于腦缺血再灌注后 3、6、12、24、72 h后分別麻醉處死。冰上取頂葉皮層，用錫箔紙包好后放入凍存管，立即存于－70℃保存待測。采用RT-PCR檢測TNF-α mRNA。TNF-α 引物序列：上游 5′-TCTCAAAACTCGAGTGACAAG-3′，下游 5′-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3′， 擴增產(chǎn)物長度446 bp。內(nèi)參 β-actin 序列：上游 5′-TGGTACCACTGGCATTGTGA-3′，下游 5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，擴增產(chǎn)物長度 545 bp。反應條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃ 2 min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，94℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，40個循環(huán)，72℃延伸10 min，將PCR擴增產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠電泳，結果置于凝膠成像分析系統(tǒng)進行吸光度分析，得到TNF-α/β-actin比值，表示TNF-α表達的相對豐度。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠觀察期內(nèi)死亡率分析 假手術組大鼠未出現(xiàn)死亡，其他組大鼠共死亡23只，經(jīng)χ2檢驗，模型組、針刺對照組、針刺督脈組間動物死亡率無顯著差異（P>0.05）。

2.2 針刺督脈對腦缺血大鼠TNF-α mRNA表達的影響 見表1。實驗結果表明，與假手術組相比，模型組在各觀測點TNF-α mRNA表達水平升高；針刺督脈組與模型組相比，在腦缺血再灌注 12、24 h 和 72 h，TNF-α mRNA 表達水平降低 （P<0.05），與針刺對照組相比，在腦缺血再灌注12 h和24 h，TNF-α mRNA表達水平降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠頂葉皮層TNF-α mRNA表達（n=6，）

表1 各組大鼠頂葉皮層TNF-α mRNA表達（n=6，）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與針刺對照組比較，▲P＜0.05。

組 別 3 h 6 h 12 h 24 h 72 h假手術組 0.263±0.031 0.275±0.028 0.287±0.069 0.264±0.083 0.281±0.056模型組 0.521±0.083*0.864±0.057*1.094±0.143* 1.152±0.149* 0.628±0.087*針刺對照組0.502±0.067 0.816±0.039 0.824±0.041 0.805±0.062△ 0.523±0.049△針刺督脈組0.487±0.058 0.807±0.063 0.665±0.034△▲ 0.716±0.073△▲ 0.504±0.085△

3 討 論

TNF-α主要參與腦梗死早期的炎癥反應，導致神經(jīng)功能損傷，其與腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）結合，可激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路，誘導各種促炎細胞因子（包括 TNF-α）表達，從而上調(diào)TNF-α mRNA表達，可見腦梗死早期TNF-α和NF-κB間可相互促進表達，減少存活神經(jīng)元數(shù)量［4］。

中醫(yī)學認為腦梗死的病機主要是機體氣血逆亂、腦脈閉阻、陰陽失和。中風急性期應用針灸治療，可行氣血、通經(jīng)絡、調(diào)陰陽，在減輕患者神經(jīng)系統(tǒng)損傷、促進功能康復等方面發(fā)揮了重要作用［5］，在中風病治療方面重視應用督脈和任脈經(jīng)穴，取得了令人滿意的療效［6］。督脈不僅為陽脈之海，統(tǒng)一身陽氣，領一身氣血，還與諸經(jīng)交匯，將氣血上輸于腦，以奉元神，故腦脈閉阻不通，可通過調(diào)節(jié)督脈經(jīng)氣，以行氣血、通瘀滯、調(diào)陽氣。而任脈為陰脈之海，可與督脈共同協(xié)調(diào)人體陰陽功能。實驗結果表明，針刺督脈治療在腦梗死12、24、72 h時間點可下調(diào)TNF-α mRNA的過度表達，提示針刺督脈在缺血性中風急性期的治療中，可能通過調(diào)節(jié)TNF-α mRNA的表達，減輕炎性反應，減少神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，從而改善腦缺血再灌注損傷。

［1］Castillo J，Moro MA，Blanco M，et al.The release of tumor necrosis factor-alpha is associated with ischemic tolerance in human stroke［J］.Ann Neurol，2003，54（6）：811.

［2］馬惠芳，林彩霞，任秀君，等.針刺對腦缺血大鼠海馬區(qū)凋亡細胞及Caspase-9蛋白表達的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（11）：25-27.

［3］Kuge Y，Minematsu K，Yamagachi T，et al.Nylon monofilament for in-traluminal middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1995，26（9）：1665.

［4］陳燕啟，劉德紅，楊光田.大鼠急性全腦缺血再灌注時NF-κB表達及意義［J］.臨床醫(yī)學研究，2004，21（7）：772-775.

［5］王鵬琴，白麗，蔡虹，等.眼針對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織半暗區(qū)Caspase-8、Caspase-3 mRNA表達的影響［J］.針灸臨床雜志，2010，26（9）：51-54.

［6］羅文舒.針灸任督脈治療中風后尿失禁的臨床研究［J］.廣西中醫(yī)學院學報，2009，12（1）：12-14.