復方三七納米顆粒對顱腦損傷大鼠TNF－α、IL－2及IL－6的影響*

張 富，楊國強，田愛林

(河北省唐山市玉田縣醫院，河北玉田 064100)

顱腦損傷可以導致患者體內細胞因子水平失衡，并可使炎癥反應持續放大，影響血腦屏障的穩定性。目前有研究證實［1］活血化瘀藥物可以透過血腦屏障，擴張腦血管，改善腦血流，加快顱內血腫的吸收和腦水腫的消除，維護腦損傷時血腦屏障的結構完整，改善其功能。筆者在臨床實踐中發現復方三七納米顆粒佐治顱腦損傷患者有很好的治療效果，并在前期動物實驗中發現:復方三七納米顆粒可改善顱腦損傷大鼠認知功能及延長生存時間，同時發現該藥具有抗血栓形成，且不增加出血風險的作用。為進一步探討復方三七納米顆粒治療顱腦損傷作用機制，我們復制了顱腦損傷大鼠模型，并在此模型基礎上觀察復方三七納米顆粒劑對顱腦損傷大鼠血清TNF-α、IL-2、IL-6含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠96只，體重200～220g，由河北醫科大學實驗動物中心提供;動物等級:一級;合格證:712101。

1.2 藥品與試劑

復方三七納米顆粒 (中藥配方顆粒廣東一方制藥有限公司，批號0708001);尼莫地平片 (拜耳醫藥保健品有限公司，國藥準字H20003010);TNF-α、IL-2、IL-6放射免疫試劑盒由北京科美東雅生物技術有限公司提供。

1.3 模型制備［2］

實驗前大鼠禁食12h，飲水自由。將大鼠稱重麻醉后固定于解剖臺上，剪去大鼠頭頂部毛發，消毒后于矢狀正中切開頭皮，剝離骨膜，暴露左側頂骨，在冠狀縫后1.5mm，中線旁左側2.5mm處，用牙科鉆鉆1個小孔，并擴大為直徑5mm的骨窗，保持硬腦膜完整;將一圓形鋼板墊 (直徑約4.5mm，厚度3.5mm)置于硬膜外，用50g擊錘從20cm高處沿套管呈自由落體沖擊于致傷墊，造成頂葉局部性腦挫裂傷，打擊后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，致傷動物蘇醒后原籠喂養。

1.4 分組及給藥

將96只大鼠隨機分為假手術組、創傷模型組、復方三七納米顆粒劑組和尼莫地平組，每組各24只，建立顱腦損傷動物模型，假手術組給予假手術處理。假手術組給予生理鹽水2mL灌胃，創傷模型組給予生理鹽水2mL灌胃，復方三七納米顆粒組按復方三七納米顆粒1.33g·kg-1相當于生藥量2.4g·kg-1制成水溶液2mL灌胃，尼莫地平組每只大鼠每天100g體重0.1mg尼莫地平片 (制成水溶液)灌胃2mL。

1.5 取材及指標檢測

分別于造模后第1、3、5d，2%戊巴比妥鈉(上海西唐生物技術有限公司提供)腹腔麻醉(3mL/kg)，迅速從大鼠腹主動脈取血5mL待測TNF-α、IL-2、IL-6，TNF-α、IL-2、IL-6量測定采用放射免疫法，具體實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.6 統計學處理

所得數據均輸入數據庫，采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學處理，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

表1 各組大鼠治療前后血清TNF－α含量 ±s)

表1 各組大鼠治療前后血清TNF－α含量 ±s)

△P＜0.05與假手術組相比;*P＜0.05與模型組相比;＊＊P＜0.01與模型組相比;▲P＜0.05與尼莫地平組相比

分組 n/只傷后1d(n=8只)TNF-α/(ng/mL)傷后3d(n=8只)TNF-α/(ng/mL)傷后5d(n=8只)TNF-α(ng/mL)假手術組24 0.92±0.23 1.03±0.29 1.05±0.31模型組 24 1.98±0.36△ 2.87±0.41△ 2.13±0.40△尼莫地平組 24 1.48±0.50* 1.93±0.51* 1.66±0.47*復方三七納米顆粒劑組 24 1.13±0.47＊＊▲ 1.19±0.45＊＊▲ 1.07±0.43＊＊▲

與假手術組相比，模型組各時間點內TNF-α含量均有明顯升高，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05);與模型組相比，尼莫地平組各時間點內TNF-α含量均下降，兩兩比較均有統計學差異(P＜0.05)，復方三七納米顆粒劑組各時間點內TNF-α含量均下降，兩兩比較均有統計學差異(P＜0.01);與尼莫地平組相比，復方三七納米顆粒劑組各時間點TNF-α含量均下降，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05)。

表2 各組大鼠治療前后血清IL－6含量 ±s)

表2 各組大鼠治療前后血清IL－6含量 ±s)

△△P＜0.01與假手術組相比;*P＜0.05與模型組相比;＊＊P＜0.01與模型組相比;▲P＜0.05與尼莫地平組相比

分組 n/只傷后1d(n=8只)IL-6/(ng/mL)傷后3d(n=8只)IL-6/(ng/mL)傷后5d(n=8只)IL-6(ng/mL)假手術組24 32.07±9.04 32.91±9.04 32.07±9.32模型組 24 66.89±13.17△△ 71.09±13.41△△ 69.39±12.36△△尼莫地平組 24 48.94±13.27* 42.93±13.77* 41.86±13.07*復方三七納米顆粒劑組 24 36.28±11.75＊＊▲ 35.38±12.87＊＊▲ 34.13±12.09＊＊▲

與假手術組相比，模型組各時間點內IL-6含量均有明顯升高，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05);與模型組相比，尼莫地平組各時間點內IL-6含量均下降，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05)，復方三七納米顆粒劑組各時間點內IL-6含量均下降，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.01);與尼莫地平組相比，復方三七納米顆粒劑組各時間點IL-6含量均下降，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05)。

表3 各組大鼠治療前后血清IL－2含量 (±s)

表3 各組大鼠治療前后血清IL－2含量 (±s)

△△P＜0.01與假手術組相比;*P＜0.05與模型組相比;＊＊P＜0.01與模型組相比;▲P＜0.05與尼莫地平組相比

分組 n/只傷后1d(n=8只)IL-2/(ng/mL)傷后3d(n=8只)IL-2/(ng/mL)傷后5d(n=8只)IL-2(ng/mL)假手術組24 5.94±0.81 6.03±0.76 6.85±0.78模型組 24 3.08±0.63△△ 3.26±0.71△△ 3.73±0.70△△尼莫地平組 24 4.89±0.83* 5.17±0.82* 5.53±0.79*復方三七納米顆粒劑組 24 5.56±0.74＊＊▲ 5.96±0.79＊＊▲ 6.65±0.80＊＊▲

與假手術組相比，模型組各時間點內IL-2含量均有明顯下降，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.01);與模型組相比，尼莫地平組各時間點內IL-2含量均升高，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05)，復方三七納米顆粒劑組各時間點內IL-2含量均升高，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.01);與尼莫地平組相比，復方三七納米顆粒劑組各時間點IL-2含量均升高，兩兩比較均有統計學差異 (P＜0.05)。

3 結論

顱腦損傷后，各種原因激活中性粒細胞、單核巨噬細胞等產生多種炎癥遞質。研究表明［3］，TNF-α和IL-6等的大量生成促進炎癥細胞的聚集和激活，導致腦血管結構和血腦屏障的破壞，使局部血管擴張、通透性增加，補體、急性期蛋白等隨血漿外滲，從而進一步加劇顱腦損害的發生。TNF-α能介導IL-2及IL-6的產生，并通過這些介質影響幾乎所有的免疫細胞、內皮細胞，參與炎癥反應和組織損傷［4］。IL-6介導的炎癥反應在顱腦損傷中扮演著重要角色，Mark-lund［5］認為IL-6在損傷發生后即刻就上升，而且損傷程度越重，血中IL-6的水平越高。有研究發現［6］人類的中性粒細胞浸潤發生在腦出血后5～72h，滲出的中性粒細胞能夠釋放各種細胞因子，如TNF-α、IL-6等，加重腦損傷。研究發現［7］，顱腦損傷后IL-2處于抑制狀態，且在7d內均處于低水平表達，但IL-2濃度隨時間延長其含量持續升高，且IL-2和IL-6同樣是患者傷情輕重的表現之一。

《黃帝內經》中有述:“若有所墮墜，惡血留內”，顱腦損傷發生病理基礎為外傷致腦中蓄血，屬中醫學中“巔頂骨折、血瘀、血證”之“實證”范疇，治療上應注重活血化瘀，如瘀血留于腦內不去則重生變故，《重訂廣溫熱論》曰:“蓋以腦為元神之府，心為藏神之臟，但為瘀熱所蔽，血毒所攻，則心靈有時而昏，甚至昏狂、昏顛、昏閉、昏痙、昏厥，而全不省人事矣”。復方三七納米顆粒主要取材于五加科人參屬植物三七的根莖，三七是經典的活血化瘀良藥， 《玉揪藥解》中指出本品可:和營止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血，其中所含的主要成分為三七總苷，三七總苷對大鼠的炎癥有明顯的對抗作用，并能對抗緩激肽、組織胺、5-羥色胺等所致毛細血管通透性增加及炎癥組織前列腺素的釋放［8］。且復方三七納米顆粒制作過程中采用表面化學方法對三七納米藥粒表面進行修飾，提高其靶向能力，控制藥物在體內的分布與釋放，同時增加其親水親油性，提高三七的生物有效性、靶向性和疾病治療的特異性。本實驗結果表明:顱腦損傷后大鼠第一天血清中TNF-α、IL-6含量較假手術組明顯升高，2d內持續升高，5d時開始下降，血清中二者濃度呈相關性，這表明顱腦損傷后促炎細胞因子表達活躍，且在5d內呈持續擴大狀態，加重顱腦損傷;IL-2含量較假手術組明顯降低，且5d內均處于低水平表達;復方三七納米顆粒可降低顱腦損傷大鼠血清各時間點的TNF-α、IL-6的含量，增加IL-2的表達，考慮與前期研究中發現的復方三七納米顆粒對抗去甲腎上腺素收縮腦血管，增加腦血流量，改善腦水腫有關。

［1］尹明華，徐曉虹.燈盞花素對缺血性記憶障礙和血腦屏障的保護作用［J］.浙江師范大學學報 (自然科學版)，2008，31(1):72.

［2］FEENEY D M，BOYESON M G，LINN R T，etal.Responses to cortical injury:I.Methodology and local effects of contusions in the rat［J］.Brain Res，1981，211(1):67-77.

［3］張文斗，楊晉生.氯胺酮對顱腦損傷大鼠血清TNF-α、IL-6及神經細胞凋亡的影響［J］.現代預防醫學，2009，36(12):2348-2349.

［4］瑪斌，韓樹生，王麗萍，等.急性顱腦損傷患者TNF、ET及CGRP含量變化及意義［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2007(6):520-522.

［5］ Marklund N，Keck C，Hoover R，etal.Administration of mono-clonal antibodies neutralizing the inflammatory mediators tumornecrosis factor alpha and interleukin-6 does not attenuate acute be-havioral deficits following experimental traumatic brain injury in therat［J］.Restor Neurol Neurosci，2005，23(1):31-42.

［6］ Mengzhou Xue，Marc R，Del Bigio.Intraceretical hemorrhage injury in rats:Relationship between blood fraction and brain cell death［J］.Stroke，2000，3(1):1721-1725.

［7］韋俐，周鵬，袁志誠.急性顱腦損傷后血清TNF-α和IL-18的含量變化及臨床意義［J］.實用臨床醫藥雜志，2009，13(2):51-54.

［8］熊進文，劉忠民，陳耿臻，等.三七總苷對重癥急性胰腺炎大鼠TNF-α、IL-6和 IL-10水平的影響［J］.中國現代醫學雜志，2009，19(20):3099-3102.