尖吻蝮蛇毒抑瘤組分Ⅰ對小鼠肺癌LLC細胞增殖的抑制作用

周 兵，張根葆，，段 婷，周 玨，吳 娟

(皖南醫學院 1.病理生理學教研室;2.病理學教研室;3.蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002)

蛇毒作為目前研究較多的一類生物毒素，其體外抗腫瘤的效果已經得到了國內外學者充分的證實，被認為對多種腫瘤細胞有著特異性的殺傷作用［1，2］。但由于蛇毒成分復雜，且副作用大，給今后開發利用這一生物資源帶來了不小的困難。因此分離純化蛇毒中具有高效低毒的有效成分，被認為是蛇毒抗腫瘤工作者研究的方向。AAVC-Ⅰ為尖吻蝮蛇毒中提取的一種活性蛋白［3］。目前已經證明其具有廣泛的抗凝血作用，但其抗腫瘤活性在國內外報道不多［4］。因此，基于實驗室前期對蝮蛇毒組分抗腫瘤做過的研究工作為基礎，進一步探討尖吻蝮蛇毒組分在體外抗腫瘤作用［5，6］。分離出尖吻蝮蛇毒組分-Ⅰ，觀察其對小鼠肺癌LLC細胞的增殖影響并初步探討其機制，為尋求開發高效低毒高純度的抗腫瘤新藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AAVC-Ⅰ是本院蛇毒研究所利用皖南尖吻蝮蛇毒粗毒經Cellulose DE-52離子交換和Sephadex G-75分子篩兩步層析后獲得的酸性蛋白質，其相對分子量約為23 ku。1640-RPMI為賽默飛世生物化學制品公司產品，胎牛血清(無支原體)為杭州四季青公司產品，四唑氮藍(MTT)試劑盒、基因組DNA抽提試劑盒、DNA-Ladder、PBS胰酶、緩沖液、雙抗(青霉素-鏈霉素)均為浙江碧云天公司產品。

1.2 細胞系及培養 小鼠肺癌LLC細胞，為本院藥理實驗室饋贈。LLC細胞為貼壁生長細胞。用含10%胎牛血清、1%的雙抗的1640培養液置于生長環境為5%CO2、37℃的飽和濕度的培養箱常規培養。

1.3 細胞形態的變化 取對數生長期的LLC細胞，調整為4×104個/ml，采用細胞爬片方法接種到六孔板，培養箱孵育 12 h，按照 12.5 μg/ml、50 μg/ml兩個終濃度加藥，對照組加等量生理鹽水，在細胞培養箱內繼續孵育48 h，取玻片倒置顯微鏡鏡檢。

1.4 細胞毒性檢測 取對數生長期的LLC細胞，胰酶消化后，調整細胞終濃度為4×104個/ml種植于96孔板，每孔加入100 μl細胞懸液，培養箱孵育12 h。實驗組每孔加入10 μl藥物至終濃度為12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml，對照組加 10 μl生理鹽水，培養箱孵育24 h。每組設6個復孔。每孔加入10 μl MTT溶液后繼續孵育4 h，繼續加入10 μl Formanzan 溶解液，繼續培養 4 h，震蕩 5 min，570 nm處測定吸光度A值。改良寇式法計算半數抑制量IC50。

1.5 細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳 按DNA抽提試劑盒操作辦法，離心收集藥物 0 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml和等量生理鹽水處理 48 h 后的細胞。PBS 洗滌兩遍，加入4 μl RNA 酶后，20 μl蛋白酶K混勻。加200 μl樣品裂解液，70℃裂解10 min，加入200 μl混勻，PBS洗滌 2次后離心，加入60 μl洗脫液收集離心柱內DNA，80V電壓下1%的瓊脂糖凝膠電泳2 h，凝膠成像儀下觀察DNA條帶形成并拍照。

1.6 統計學處理 所得數據以SPSS 18.0統計軟件包進行處理。正態或者近似正態數據用s表示，AAVC-Ⅰ比較采用Kruskal-Wallis檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 尖吻蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ作用后細胞形態學變化 對照組LLC細胞鏡下可見呈現不規則多邊形、條索狀貼壁生長，輪廓清楚，生長旺盛。用12.5 μg/ml、50 μg/ml藥物處理后 24 h，細胞縮小、形態變圓，胞膜卷曲、褶皺、細胞聚集、死亡(圖1)。

圖1 AAVC-Ⅰ作用24 h后細胞形態學的變化a 對照組;b 12.5 μg/ml組;c 50 μg/ml組Fig 1 Morphological change of LLC cell treated for 24 hours by different dose of the drug

2.2 尖吻蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ對LLC細胞的增殖的影響 MTT法檢測結果顯示，AAVC-Ⅰ能有效抑制LLC細胞的增值。其作用24 h后半數抑制濃度IC50值為43.823 μg/ml。并且隨著藥物濃度的加大，其抑制作用明顯上升(P＜0.05)(表1)。

2.3 尖吻蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ處理后細胞DNA電泳結果 在三種濃度梯度的藥物作用LLC細胞48 h后，相對于對照組，藥物作用組DNA片段抽提電泳均可見階梯狀DNA條帶的形成(圖2)。

3 討論

肺癌是一類較為常見的惡性腫瘤，伴隨著全球工業化進程的加快和環境污染程度的加大，現肺癌的發病率高居世界首位［7］。肺癌的預后極差，五年生存率僅為5% ～15%［8］。傳統的手術和放化療對于肺癌的治療效果未取得突破性進展，因此，尋求新的生物學治療手段已成為肺癌研究的熱點，而蛇毒抗腫瘤的研究為此提供了很好的方向。

表1 AAVC-I作用LLC細胞24 h后MTT法檢測結果(n=6，±s，P＜0.05)Tab 1 AAVC-Ⅰon proliferation of LLC cells after 24-hour treatment(results of MTT detection)

表1 AAVC-I作用LLC細胞24 h后MTT法檢測結果(n=6，±s，P＜0.05)Tab 1 AAVC-Ⅰon proliferation of LLC cells after 24-hour treatment(results of MTT detection)

注:#表示與 AAVC-Ⅰ濃度 12.5 μg/ml組比較，P ＜0.05

AAVC-Ⅰ濃度(μg/ml)570 nm A值平均秩 抑制率(%)0.498 ±0.22 －12.5 0.400 ±0.01 31.04 25 0.320 ±0.03# 45.45 50 0.190 ±0.01# 66.92 HC 21.600 P 0 0.000

圖2 AAVC-Ⅰ作用LLC細胞后DNA電泳圖Fig 2 The DNA agarose gel electrophoresis of LLC cell treated with AAVC-Ⅰ

隨著蛇粗毒分離、純化技術的提高，蛇毒提取物對于腫瘤細胞的抑制和殺傷作用日益受到人們關注。國外學者Liang Zhang等人以眼鏡蛇毒提取物ACTX-6對人肺癌A549細胞進行體外實驗，證實對其有強效的殺傷作用［9］。Sheng-Huei Yang等人發現從眼鏡蛇毒中提取的CTXⅢ，對人白血病K562細胞有明顯的抑制作用［10］，張及祿等人從蝮蛇毒中分離的小分子多肽sis對宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞SMMC.7721和胃腺癌細胞SGc-7901均有殺傷作用［11］。與傳統的抗癌藥物相比，從蛇毒中分離出的抗腫瘤成分具有特異性強的優點，對腫瘤細胞進行殺滅、抑制的同時對正常細胞毒副作用小［12］。

本實驗通過尖吻蝮蛇毒提取物AAVC-Ⅰ對小鼠肺癌LLC細胞研究，結果表明AAVC-Ⅰ能夠有效地抑制LLC細胞的增殖，并呈現出劑量依從關系，其中24 h半數抑制量約為43.823 μg/ml。而在不同濃度作用細胞24 h后，顯微鏡下可見細胞懸浮、聚集，邊界不清，胞核固縮。瓊脂糖DNA電泳顯示明顯的DNA凋亡片段條帶。均證明 AAVC-Ⅰ對LLC細胞有較強的抑制作用。其機制可能是通過損害細胞的細胞膜、干預信號轉導、促進相關基因和蛋白的高表達等方式促進細胞凋亡。但具體的作用機制還需要接下來進一步深入的研究，為今后在臨床上應用蛇毒提取物治療腫瘤提供了一定的實驗依據。

［1］SON DJ，PARK MH，CHAE SJ，et al.Inhibitory effect of snake venom toxin from Vipera lebetina turanica on hormone-refractory human prostate cancer cell growth:induction of apoptosis through inactivation of nuclear factor kappaB［J］.Mol Cancer Ther，2007，6(2):675－683.

［2］SARRAY S，BERTHET V，CALVETE J J，et al.Lebectin，a novel C-type lectin from Macrovipera lebetina venom，inhibits integrinmediated adhesion，migration and invasion of human tumour cells［J］.Lab Invest，2004，84(5):573 －581.

［3］張根葆，張毅，孔巖，等.五步蛇毒蛋白C激活劑的純化與活性分析［J］.蛇志，2008，20(4):249 －251.

［4］孔巖，李曙，張根葆，等.蝮蛇蛇毒PCA對實驗性心肌梗死大鼠血凝狀態的影響［J］.皖南醫學院學報，2009，28(5):316－318，391.

［5］王國光，許敏，段海峰，等.蝮蛇毒提取物誘導白血病細胞K562凋亡［J］.中國實驗血液學雜志，2008，16(3):516－519.

［6］戚之琳，楊敏，張根葆，等.皖南蝮蛇蛇毒抗凝組份抗白血病作用的實驗研究［J］.皖南醫學院學報，2006，25(2):89 －91.

［7］WINGO P A，R IES L A，G IOVINO G A，et al.Annua l report to thenationon the status of cancer，1973?1996，with a special sectionon lung cancer and tobacco smoking ［J］.Nat l Cancer Inst，1999，91(8):675 －690.

［8］張敏，白春學，張新，等.肺腺癌SPC-A-1細胞表皮生長因子受體表達水平對其增殖的影響［J］.中華結核和呼吸雜志，2005，28(5):337－341.

［9］LIANG ZHANG，LI CUI.A cytotoxin isolated from Agkistrodon acutus snake venom induces apoptosis via Fas pathway in A549 cells［J］.Toxicology in Vitro，2007，(21):1095 － 1103.

［10］YANG SH，TSAI CH，LU MC，et al.Effects of cardiotoxin Ⅲ on expression of genes and proteins related to G2/M arrest and apoptosis in K562 cells［J］.Mol Cell Biochem，2007，300(1-2):185 －190.

［11］張及祿，文慧民，孫德軍.蝮蛇毒小分子多肽的分離、純化及其抗腫瘤作用研究［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(4):217－220.

［12］RUI J，HUAI J G，ZHANG Y，et al.Purification and characterization of anti-clotting protein component(ACPF-7221)from venom of Agkistrodon acutus［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(18):2169－2173.