穿孔素和顆粒溶素在多發性肌炎和皮肌炎中的表達

李 志，張夢瑩，宣 丹，毛桐俊，陸進明，徐 亮

(皖南醫學院附屬弋磯山醫院 風濕免疫科，安徽 蕪湖 241001)

特發性炎性肌病(IIM)是一組主要以四肢近端肌肉及頸、咽部肌肉受累為主的結締組織疾病。多發性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)是IIM最常見的兩種類型。近年穿孔素(perforin)和顆粒溶素(granulysin)在炎性肌病的研究日趨增多。本文通過檢查患者血清穿孔素和顆粒溶素在炎性肌病的表達從而探討兩者在炎性肌病血清中表達的差異。

1 對象和方法

1.1 對象與分組 選取2010年2月～2011年2月我院收治的初發PM和DM 20例，均符合診斷標準［1］。其中PM 8例，男性2例，女性6例，平均年齡(47.25±7.36)歲;DM 12例，男性5例，女性7例，平均年齡(47.08±11.28)歲，初發類風濕關節炎10例，男性4 例，女性 6 例，平均年齡(45.70 ±14.50)歲，正常對照組8例，男性4例、女性4例，平均年齡(48.50±10.52)歲。在PM和DM組進行比較時，DM組選取10例。將PM和DM整體作為炎性肌病組(20例)與對照組及類風濕關節炎組進行兩兩比較，判斷穿孔素和顆粒溶素在以上組間的差異。

1.2 方法 PM/DM患者、類風濕關節炎患者和對照組均清晨空腹取靜脈血3 ml，分離血清于－20℃冰箱冷凍保存備用。肌酸激酶、肌酸激酶同工酶等由臨床檢驗科室以免疫比濁法測定完成。血清穿孔素和顆粒溶素的測定，按所購買ELISA試劑盒說明書進行。空白對照吸光度進行調零，依據標準品濃度生成標準曲線，以各樣品的吸光度在標準曲線上得到對應的樣本濃度。

1.3 統計學處理 兩組間指標的比較以獨立兩樣本t檢驗分析，若方差不齊以t'檢驗;3組間指標比較行方差分析，若方差不齊則進行秩和檢驗;炎性肌病組樣本量少，兩變量進行秩相關分析。

2 結果

2.1 穿孔素和顆粒溶素在PM和DM中的比較穿孔素在PM和DM患者血清中表達水平比較，t'=－0.900，差異無統計學意義(P ＞0.05);顆粒溶素在兩組間比較，t=0.348，差異無統計學意義(P＞0.05)，結果見表 1。

表1 穿孔素和顆粒溶素在PM和DM的表達

2.2 穿孔素和顆粒溶素在3組間的比較 穿孔素在炎性肌病組、正常對照組和類風濕關節炎組間無顯著差異(P＜0.05);顆粒溶素在類風濕關節炎組和炎性肌病組均高于對照組(P＜0.05)，而在類風濕關節炎組和炎性肌病組間無差異(P＞0.05)，見表2。穿孔素進行方差分析(F=0.357，P=0.703)，3組間無差異。顆粒溶素方差不齊行秩和檢驗(F=3.873，P=0.03)。炎性肌病組和類風濕關節炎組分別與對照組比較(P＜0.01和 P＜0.05);炎性肌病組和類風濕關節炎組間比較(P＞0.05)。

表2 3組穿孔素和顆粒溶素的比較

2.3 穿孔素和顆粒溶素相關分析 對20例炎性肌病患者(PM/DM)的穿孔素和顆粒溶素進行相關分析，因樣本量偏小故不能進行多因素的相關及回歸分析，且穿孔素和顆粒溶素非正態分布，以秩相關(spearman等級相關)檢驗，發現兩者不存在相關性(rs=0.018，P ＞0.05)。

2.4 炎性肌病激素敏感與抵抗的比較 隨訪6月發現5例炎性肌病激素抵抗患者(PM 2例、DM 3例)，選取7例炎性肌病激素敏感患者(PM 3例、DM 4例)進行對比研究。激素敏感與抵抗的標準以Thomas標準判斷［2］。經兩組樣本秩和檢驗，兩者治療前穿孔素、顆粒溶素、肌力、肌酸激酶無差異(P＞0.05)。提示穿孔素和顆粒溶素、肌力及肌酶不能預測炎性肌病對激素治療敏感與否。

3 討論

多發性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織中有大量的T淋巴細胞浸潤，在PM中主要為CD8+T細胞，該細胞能分泌大量的穿孔素［3］，PM肌活檢中，與肌細胞接觸的CD8+T細胞有43%的細胞穿孔素呈偏向性分布。而穿孔素在DM的T細胞中呈彌漫性分布。由此推測，在DM中T細胞可能是被非特異性活化，而在PM中T細胞具有抗原特異性，識別肌細胞表面抗原，分泌穿孔素殺傷靶細胞［4］。日本學者［5］通過免疫組化發現PM肌肉組織中穿孔素表達陽性的CD8+T細胞占9.9%，而在DM中很少出現陽性。從而推斷穿孔素在PM發揮著重要的溶解肌細胞作用。

在體內免疫毒性細胞殺傷靶細胞的途徑和機制主要有兩種［6］:①FAS途徑經死亡受體起作用;②毒性顆粒途徑。當細胞毒性T細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK)細胞受到抗原刺激后，被活化并識別靶細胞，CTL和NK細胞內胞漿顆粒重定向并移至與效應靶細胞接觸部位，通過出胞作用以分泌性溶酶體形式將毒性顆粒釋放到細胞間隙。毒性顆粒成分主要包括穿孔素和顆粒酶。CTL和NK細胞的溶細胞顆粒中除了發現穿孔素、顆粒酶外還有顆粒溶素［7］。顆粒溶素是存在于CTL和NK胞漿顆粒中的溶細胞蛋白質分子，并有促進炎癥反應作用［8］。顆粒溶素損傷細胞的機制可能是當顆粒溶素和靶細胞帶負電荷的線粒體膜脂質結合導致溶解活性發生［9］。這種機制誘導細胞色素C的釋放和線粒體功能的下降，這種改變與穿孔素小孔的形成有關［10］。Walch 等［11］發現在穿孔素存在下，顆粒溶素依賴的細胞溶解作用加強。也就是說兩者相互協同損傷細胞。我們的研究擬探討炎性肌病患者血清穿孔素和顆粒溶素是否呈高表達，及兩者是否存在相關性。本研究通過對比炎性肌病組(包括DM和PM)和類風濕關節炎組及正常對照發現:穿孔素在炎性肌病組、正常對照組和類風濕關節炎組間無顯著差異(P＜0.05);顆粒溶素在類風濕關節炎組和炎性肌病組均高于對照組(P＜0.05)，而在類風濕關節炎組和炎性肌病組間無差異(P＞0.05)。提示顆粒溶素在炎性疾病中的意義可能較穿孔素還要重要。一直以來對穿孔素的研究主要集中在PM，我們通過PM組和DM組間t檢驗未發現血清中穿孔素和顆粒溶素的表達在PM和DM存在差異。這與日本學者［5］通過免疫組化檢測CD8+T細胞中穿孔素表達結果不同。

臨床中常遇到激素治療抵抗的患者，如何在治療早期找到預測激素抵抗的標志物是非常有意義的。Sarwal等［12］在研究激素治療腎移植排斥發現:在激素治療抵抗的移植組織中顆粒溶素染色較激素敏感者高。得出:組織顆粒溶素的致密染色是糖皮質激素抵抗的組織標志。提示當顆粒溶素高表達時，可以出現糖皮質激素抵抗。Ikezoe等［13］發現在多發性肌炎治療前的活檢標本中，激素抵抗患者組織較激素治療敏感患者組織顆粒溶素在CD8+淋巴細胞中表達明顯升高。穿孔素和顆粒溶素在同種顆粒中表達。雖然糖皮質激素抵抗的多發性肌炎中穿孔素表達升高，但在糖皮質激素抵抗組和敏感組間沒有顯著差異。這與我們的研究是一致的，我們對激素敏感與抵抗的炎性肌病患者比較發現穿孔素的表達沒有差異(P＞0.05)。Ikezoe還得出顆粒溶素的表達和糖皮質激素抵抗成正相關，因而提出:Sarwal［12］將顆粒溶素的表達可作為腎移植急性排斥激素抵抗的標志，那么顆粒溶素也可能作為多發性肌炎激素抵抗的標志。因此我們希望在血清中發現顆粒溶素與激素抵抗的關系，但我們在對比激素敏感與抵抗的炎性肌病患者中未發現顆粒溶素表達存在差異(P＞0.05)，即顆粒溶素尚不能作為預測療效的標志。這可能與我們的樣本含量偏小有關。

有學者［14］提出顆粒溶素和糖皮質激素受體多態性可能是預測炎性肌病對糖皮質激素反應性有潛在意義的兩個研究方向。穿孔素和顆粒溶素在炎性肌病免疫損傷中的意義日益受到關注。

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