菊米提取液對人胃癌細胞AGS增殖和凋亡的影響

司馬軍 金晨宇 方迪龍 金哲柱 鄭鳴之

菊米多為菊科植物甘野菊(chrysanthemum seticuspe)的花蕾制作而成。據(jù)《增廣本草綱目》記載，菊米為處州一種山中野菊，土人采其蕾(蕊)干之，如半粒綠豆大，甚香且清圓黃亮。目前被廣泛用于保健茶飲。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)菊米富含揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、菊米內(nèi)脂、野菊花素、黃酮等營養(yǎng)成分，也含有小白菊內(nèi)酯、木犀草素、芹菜素、萜類化合物等成分。已有研究證實［1～5］，菊米提取液可通過影響 NO 途徑，增加 NOS活性和內(nèi)皮細胞超極化因子(EDHF)釋放，發(fā)揮舒張血管、對抗實驗性心律失常和心肌缺血再灌注損傷等作用;小白菊內(nèi)酯可抑制大鼠血管平滑肌細胞的增殖;萜類化合物可誘導人肝癌SMMC－7721細胞凋亡;木犀草素、芹菜素等可通過抗增殖和誘導凋亡抑制惡性腫瘤細胞的增長［6，7］。故推測，菊米提取液可能對腫瘤細胞生長產(chǎn)生影響，為此筆者將不同濃度的菊米提取液與人胃癌細胞AGS共同培養(yǎng)，觀察其對AGS細胞增殖和凋亡的影響。

材料與方法

1．材料:人胃癌細胞AGS購自中科院上海細胞庫，野菊米購自遂昌華昊菊米有限公司，DMEM(dulbeccos modified eagle medium)細胞培養(yǎng)液購自 Gibco公司，噻唑藍(thiazole blue，MTT)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)及二甲基亞砜(DMSO)均購自 Sigma公司，casapase－3/7、casapase－6活性檢測試劑盒購于Promega公司，胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司。菊米提取液的制備:取干的野菊米加入10倍的無水乙醇室溫萃取24h，過濾去沉淀，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮即可。

2．MTT法測定細胞生存率:用含2%FBS(fetal bovine serum)的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至3×104個/毫升，按180微升/孔(6×103個左右細胞量)接種于96孔板中，16h后給予各種不同處理并于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后各孔中按1∶9加入5mg/ml MTT(用 pH 7．4 PBS配制)，再置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，加入DMSO 150微升/孔，搖床30min后，在酶聯(lián)檢測儀上570nm波長處測吸光度(A)值，以A值間接反映存活細胞數(shù)量，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1－A給藥/A對照)×100%。

3．細胞凋亡測定:采用PI單染分析法用流式細胞儀測定細胞周期以反映細胞凋亡情況。收集各處理組細胞均勻打散，PBS(phosphate buffer saline)沖洗3次后于70%乙醇中4℃固定18h，洗去乙醇，加入RNase(50mg/ml)消化并用PI(100mg/ml)染色30min，用流式細胞儀檢測細胞亞二倍體凋亡峰，根據(jù)此亞二倍體峰計算凋亡細胞的百分率。

4．caspase－3/7，caspase－6活性分析:具體操作根據(jù) Promega試劑盒說明書，即將細胞均勻接種于96孔板中，給予不同處理后，各孔加入與培養(yǎng)基等體積的caspase－3/7，caspase－6發(fā)光底物(分別為Z－DEVD－R110，Z－VEID－氨基螢光素)，輕輕搖勻30s，室溫孵育3h后于多功能熒光分析儀Wallac 1420 Explorer上測量螢光值(relative light units，RLU)。

結(jié) 果

1．菊米提取液對AGS細胞增殖的影響:隨藥物質(zhì)量濃度0．001～0．010mg/ml增加，細胞的增殖抑制率逐漸上升，且與菊米提取液質(zhì)量濃度呈正相關(guān)(r=0．905，P ＜0．05)，0．01mg/ml時對細胞增殖的抑制作用最大，達到(58．32 ±2．68)%(圖1)。

2．菊米提取液對AGS細胞凋亡的影響:AGS細胞與含有菊米提取液0.001～0．010mg/ml的完全培養(yǎng)基或不含藥的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48h后，收集全部培養(yǎng)細胞經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，不含藥的對照組細胞凋亡發(fā)生率為(1．77±0．60)%，含菊米提取液0.001、0．002、0．005、0．010mg/ml的藥物組細胞凋亡率分別為(4．63 ± 1．45)%、(11．03 ± 2．01)%、(15.53 ±1．96)%及(23．77 ±1．65)%。與對照組相比，除了0．001mg/ml藥物濃度組，其余3個藥物濃度組均顯著提高了細胞凋亡率(p＜0．05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖2)。

3．菊米提取液對 caspase－3/7、caspase－6酶活性的影響:AGS細胞與含有菊米提取液 0．001～0.01mg/ml的完全培養(yǎng)基或不含藥的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48h后，與對照組相比，除了0．001mg/ml藥物濃度組，其余 3個藥物濃度組的 caspase－3/7、caspase－6酶活性均有顯著增加(p＜0．05)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(圖3)。

討 論

誘導和促進腫瘤細胞凋亡是治療腫瘤的重要策略之一［8］。臨床上常用的化療藥物多具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但不良反應較大，也易產(chǎn)生耐藥性。因此，從天然植物中獲取不良反應小、不易產(chǎn)生耐藥性的抗癌新藥越來越受到人們的重視。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，菊米提取液在體外能明顯抑制胃癌細胞AGS生長，而且這種作用出現(xiàn)一定的濃度依賴性。菊米提取液對胃癌AGS細胞的增殖抑制率隨著濃度的增加而增加(P ＜0．05)，在4．713×10－3mg/ml可使半數(shù)細胞生長受抑制，這可能與其誘導細胞凋亡有關(guān)。流式細胞術(shù)檢測菊米提取液對AGS細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，菊米提取液可隨著濃度的增加而增大細胞凋亡率，0．01mg/ml的菊米提取液處理AGS細胞48h后，其細胞凋亡率為對照組的13．5倍。在對AGS細胞caspase－3/7酶及caspase－6酶活性的檢測實驗中證實了菊米提取液可通過誘導細胞凋亡而抑制腫瘤細胞的生長。

圖3 菊米提取液對胃癌AGS細胞caspase－3/7、caspase－6酶活性的影響

細胞凋亡是基因控制的細胞自主性死亡過程，它是在基因調(diào)控下的一個嚴密完整的程序過程。其中caspase家族在凋亡過程中起到關(guān)鍵性的作用，能引起細胞在形態(tài)和生物學特性的改變。caspase－3、caspase－7與caspase－6是主要的處于細胞凋亡下游的凋亡效應分子。caspase－3被稱為“死亡蛋白酶”，是細胞凋亡的生物學標志，其活化及活性受到多種因素的調(diào)節(jié)。已有研究表明，caspase－7與caspase－3在誘導腫瘤細胞凋亡的過程存在正相關(guān)，但在細胞凋亡級聯(lián)反應中 caspase－7究竟位于caspase－3 的下游，還是平行關(guān)系，意見不一［9］。caspase－6參與細胞凋亡的執(zhí)行并可降低凋亡信號誘導細胞死亡的閾值，其與caspase－3二者有38%同源性，二者是不同凋亡途徑共同的下游路徑，但二者的調(diào)控機制及相互關(guān)系并不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)，caspase－3蛋白早于caspase－6蛋白的激活，并與caspase－6蛋白的活化有密切關(guān)系，活化的caspase－6蛋白反過來又能活化caspase－3蛋白，形成對caspase－3蛋白活化的正性循環(huán)。本實驗顯示，隨著菊米提取液濃度的增加，用熒光底物檢測法觀察到caspase－3/7酶和caspase－6酶活性的改變呈劑量依賴性增高，0．01mg/ml的菊米提取液處理AGS細胞48h，其酶活性分別為對照組的4．3倍和2．0倍。提示caspase－3/7基因和caspase－6蛋白基因的蛋白翻譯水平同樣可能是菊米提取液的作用位點，菊米提取液可能通過增加caspase－3/7、caspase－6蛋白表達、活化而促進細胞凋亡。有關(guān)caspase家族在細胞凋亡過程中的相互作用機制，還有待今后進一步的深入研究。

自由基導致DNA損傷且抑制損傷后的修復，是自由基誘導細胞癌變的主要原因。以往的研究結(jié)果顯示，菊米提取液可通過增加內(nèi)皮細胞內(nèi)的一氧化碳合酶(nitric oxide synthase，NOS)，使NO生成增加而發(fā)揮舒張血管的作用，該結(jié)果提示菊米提取液具有抗氧化的作用［2］。因此，菊米提取液的抗氧化能力也可能是其抗腫瘤的機制之一，這有待進一步深入研究。

目前關(guān)于菊米提取液抗胃癌機制的相關(guān)研究還不多。本研究顯示，菊米提取液能誘導胃癌細胞系AGS凋亡，抑制其增殖。為菊米提取液今后用于臨床治療胃癌提供一定的理論基礎。

1 徐策，葉挺梅，朱立，等．菊米提取液抗實驗性心律失常作用的研究［J］．中國應用生理學雜志，2007，23(4):399－402

2 葉挺梅，徐和靖，汪洋，等．菊米提取液舒張血管作用及其機制研究［J］．中國病理生理雜志，2007，23(4):644－647

3 葉挺梅，陳文良，朱立，等．菊米提取液對抗心肌再灌住損傷［J］．中國病理生理雜志，2008，24(12):2328－2332

4 翁少翔，單江，徐耕，等．小白菊內(nèi)酯抑制胎牛血清誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖及信號轉(zhuǎn)導機理［J］．中國藥理學與毒理學雜志，2002;16(5):331－335

5 張琪，王勤，苗瑞東，等．盤花垂頭菊中兩種新型倍半萜類化合物抑制人肝癌 SMMC－7721細胞生長［J］．藥學學報，2002，37(12):993－995

6 張芳芳，沈漢明，朱心強．木犀草素抗腫瘤研究作用的進展［J］．浙江大學學報:醫(yī)學版，2006，35(5):573－578

7 胡太平，曹建國．芹菜素誘導人胃癌細胞凋亡作用及機制研究［J］．國際病理科學與臨床雜志，2007，27(1):6－11

8 Gazitt Y，Akay C．Arsenic trioxide:An anticancer missile with multiple warheads［J］．Hematology，2005，10(3):205 － 213

9 胡會華，周士福，李青國．新輔助化療中凋亡效應因子caspase－7、caspase－3及凋亡抑制因子survivin關(guān)系初探［J］．中國綜合臨床，2007，23(10):896－898