CXCR4和MMP－9在胃癌組織中表達及其與淋巴結轉移的關系

徐 斌 韓紹偉 周笑珍 李立義 蔣 平

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居我國消化道惡性腫瘤的首位。復發和轉移是胃癌死亡最主要的原因，其中淋巴轉移是其最常見的轉移方式之一，但分子生物學機制仍不十分明確。研究發現淋巴結轉移是胃癌患者預后的獨立危險因素，對腫瘤分期和治療有重要意義［1］。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)是趨化因子家族重要成員，通過與其配體CXCLl2間的相互作用在包括胃癌在內的多種腫瘤的發生、進展和轉移中發揮著重要的作用［2］。基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)是一種能降解細胞外基膜及其他細胞外基質成分的重要蛋白酶，具有促進腫瘤浸潤和轉移的作用。胃癌組織中CXCR4與MMP－9表達與淋巴轉移的關系及其相關性目前尚鮮見報道。本研究應用(RT－PCR)及S－P免疫組化方法檢測CXCR4和MMP－9在30例無淋巴轉移與46例有淋巴轉移人胃癌組織中的表達水平，并探討CXCR4和MMP－9的表達及與胃癌淋巴結轉移的關系及兩者相關性。

材料與方法

1．材料:76例胃癌組織標本取自2009年12月～2010年12月在筆者醫院普外科行手術切除術患者，其中男性52例，女性24例，患者年齡26～79(57．0±1．8)歲，術前均未行放化療，所有病例術前病例學證實為胃癌。腫瘤分期按照2002年國際抗癌聯盟(U1CC)頒布的胃癌TNM分期方案:PN030例，PN135例，PN26例，PN35例。每份標本于術后10min內取材于腫瘤組織，正常組織(距腫瘤組織邊緣＞5cm，做正常對照)。全部標本取材后迅速分成兩份，分別置于10%中性甲醛中固定和－80℃冰箱保存，備用。

2．試劑:鼠抗人CXCR4抗體購至美國Sigma公司，兔抗人MMP－9抗體購自美國Epitomics公司，免疫組化S－P試劑盒購自德國寶靈曼公司。CXCR4，MMP－9引物由北京奧科生物技術公司設計。總RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購于美國Gibico BRL公司。

3．方法:(1)S－P法進行免疫組織化學染色法檢測CXCR4和MMP－9蛋白表達:組織切片脫、蠟脫水及雙氧水室溫孵育后，組織抗原修復10min(用pH 6．0的0．01mol/L檸檬酸緩沖液，于微波爐中94℃加熱，每次5min，共2次)，滴加一抗和二抗。DAB顯色，顯微鏡下控制染色程度。操作過程中嚴格質控。用已知陽性的胃癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗，作為陰性對照。(2)免疫組織化學結果判斷:CXCR4和MMP－9均為胞膜或胞質表達，以細胞膜和(或)細胞質呈棕黃或棕褐色者為陽性細胞，隨機計數10個高倍視野(×400)，每個視野讀取200個細胞計數陽性細胞數，計算陽性率，并取平均值。所有切片均用盲法計數。陽性表達判斷參照Mattern等［3］的計數方法。(3)反轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)檢測CXCR4mRNA和MMP－9mRNA表達:胃癌標本從－80℃冰箱內取出后，迅速置于研缽中，在液氮中研磨為粉末狀，按試劑盒操作說明提前總RNA。取2μg總RNA，用MMLV反轉錄酶試劑盒(GIBGO－BRL)合成cDNA，以3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內對照。擴增引物為:CXCR4前向引物5'－AAGAAACTGAGAAGCATGACC－3'，后向引物 5'－GAAACTGGAACACAACCACC－3'，擴增片段大小為406bp。MMP－9前向引物5'－TCAGGGAGACGCCCATTT－3'，后向引物5'－TCGGGCAGAAGCCGAAG－3'，擴增片段大小為398bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統成像，并確定條帶光密度值。

4．統計學方法:應用SPSS15．0統計軟件對實驗數據進行分析。采用Fisher確切概率法分析MMP－9和CXCR4表達與淋巴結轉移的相關性;MMP－9與CXCR4相關性檢驗采用Spearman等級相關分析。p＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．CXCR4和MMP－9蛋白在胃癌組織中的表達:CXCR4在癌旁正常胃組織中無陽性表達，在pN0組胃癌組織中陽性表達率26．67%(8/30)。MMP－9在癌旁正常胃組織陽性表達率為15．79%(12/76)，在pN0組胃癌組織中陽性表達率46．67%(14/30)，差異有統計學意義(p＜0．05)。依據2002年國際抗癌聯盟(U1CC)頒布的胃癌TNM分期，pN0胃癌組織中CXCR4和 MMP－9的陽性表達率(15．79%和46.67%)與 pN1組(65．71%和 74．29%)差異有統計學意義(χ2=9.873，P=0.002 和 χ2=5.206，P=0.023);且顯著低于pN2+pN3組，差異有統計學意義(p＜0．05)(MMP－9陽性表達在pN1和pN2+pN3間差異無統計學意義，P=0．061)。pN2組，pN3組CXCR4和MMP－9在胃癌組織中的陽性表達率分別為，差異無統計學意義(P＞0．05)。各組腫瘤組織切片經PBS代替特異性一抗作為空白對照，腫瘤組織鏡下均無陽性表達。見圖1、圖2、表1。

表1 CXCR4和MMP－9在不同淋巴結轉移胃癌組織中的表達

2．CXCR4mRNA和MMP－9mRNA在胃癌組織中的表達:如圖 3所示，MMP－9mRNA和 CXCR4mRNA在胃癌組織中的表達隨淋巴轉移增加而表達明顯上調。

圖3 CXCR4和MMP－9的表達與淋巴轉移關系

3．經Spearman等級相關分析:胃癌組織CXCR4的陽性表達水平與MMP－9的陽性表達水平呈正相關(r=0．406，P ＜0．01)，見表 2。

表2 胃癌中CXCR4與MMP－9表達的關系

討 論

淋巴結轉移是影響胃癌患者根治術后生存率的最重要因素之一，并且淋巴管浸潤是獨立的死亡危險因素之一，其中MLR與胃癌患者術后生存時間存在直線關系［4］。因此早期發現及阻斷胃癌淋巴結轉移，從而提高患者預后值得我們進一步研究。

CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)是一個編碼352個氨基酸且高度保守的G蛋白偶聯7次跨膜受體，與其特異性配體CXCLl2所構成的CXCL12/CXCR4生物學軸(CXCL12/CXCR4 biological axis)在多種腫瘤的侵襲與轉移中發揮重要作用［5］。惡性腫瘤細胞高表達趨化因子受體 CXCR4，并可能在CXCL12趨化、牽引下致使腫瘤細胞轉移至作為配體產生源的某些器官(如肺、骨、肝、腎、淋巴結等)，從而形成器官特異性的轉移［6］。Kato等［7］研究發現CXCR4與乳腺癌的侵襲及轉移相關，并且可能促進乳腺癌的淋巴轉移。有研究證明CXCR4促進子宮頸癌向盆腔淋巴結組織轉移［8］。本實驗中，免疫組織化學法檢查結果顯示，CXCR4陽性在伴有淋巴結轉移的胃癌組織中陽性表達率為73.91%，明顯高于無轉移者(36．37%)，并且在pN2+pN3組表達明顯高于pN1組，差異有統計學意義(p＜0．05)。筆者還發現，隨淋巴結轉移增加 CXCR4 mRNA表達明顯上調(p＜0．05)。以上結果提示趨化因子受體CXCR4的表達可能促進胃癌的淋巴結轉移，其可能機制為胃癌組織高表達CXCR4與淋巴結選擇性高表達CXCR4特異性配體CXCL12，從而促進腫瘤的淋巴轉移。另外，Iwanaga等發現，表達CXCR4的人胃癌裸鼠模型經CXCR4拮抗劑AMD3100治療后的，腫瘤容積較對照組減小27．6%，且未見明顯的毒性癥狀。因此，阻斷CXCR4蛋白信號途徑可能是治療胃癌及其轉移的有效策略。

MMP－9(基質金屬蛋白酶－9)是MMP－s(基質金屬蛋白酶)家族的重要成員之一，在多種腫瘤的發生、發展中起重要作用。激活狀態的MMP－9調節ECM的降解過程，水解細胞基膜及外基質中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和凝膠、彈力蛋白成分，導致基膜破壞，腫瘤細胞浸潤結締組織基質，侵入小血管和淋巴管而發生轉移。最近發現，MMP－9在胃黏膜的表達是胃癌發生的晚期事件，是胃黏膜上皮細胞發生惡變的標志，其過度表達對胃癌的發生，發展起重要作用［9］。本實驗中，免疫組化結果顯示，MMP－9在人胃癌組織的陽性表達率明顯高于正常胃組織(p＜0．05)，伴有淋巴結轉移者高于無轉移組(p＜0．05)。本實驗還發現，隨淋巴結轉移增加MMP－9 mRNA表達明顯上調(p＜0．05)。說明MMP－9與胃癌的發生及淋巴結轉移有關，且MMP－9高表達的胃癌組織具有較強的淋巴管侵襲及淋巴結轉移能力;MMP－9可作為評估胃癌惡性程度的及淋巴結轉移情況的一個指標。

分析CXCR4和MMP－9的表達與胃癌淋巴轉移的關系發現，伴有淋巴轉移的胃癌組織的CXCR4和MMP－9的陽性表達明顯高于無轉移者，隨著胃癌淋巴轉移的分期增加，CXCR4和MMP－9的表達相應上調。在CXCR4表達上調的胃癌組織，MMP－9表達亦相應上調。以上結果提示CXCR4和MMP－9的高表達可能是胃癌淋巴轉移的重要分子標志。兩者在介導胃癌的淋巴轉移間具有協同效應，然而關于兩者在介導胃癌淋巴轉移的具體機制的研究未見報道。進一步研究CXCR4和MMP－9在胃癌淋巴轉移中的相互作用及其機制，有助于進一步闡明胃癌淋巴轉移的具體機制，可能為評估胃癌的淋巴轉移情況提供分子標志物，并為進一步治療和預防胃癌的淋巴轉移提供實驗數據和理論基礎。

綜上所述，本研究表明CXCR4和MMP－9的表達與胃癌的淋巴結轉移顯著相關，并隨淋巴轉移的分期增加其陽性表達明顯上調，而且兩者之間存在協同效應。因此筆者推測，CXCR4和MMP－9可能共同介導胃癌的淋巴轉移。但其具體機制尚未明確，有待進一步研究。

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