燈盞花素對糖尿病大鼠腎皮質糖基化終產物受體mRNA表達的影響

孫潔敏 馬曉蘭 沈建國 姚美芬 李璐璐 李 琦

隨著胰島素的廣泛應用和各種口服抗糖尿病藥的發現，目前嚴重影響糖尿病患者生存質量的主要原因是各種并發癥。其中糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最為嚴重的并發癥之一。近年來國內外大量研究表明晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)以及氧化應激在DN的發生發展中起到了很大的作用［1］。燈盞花(erigeronbreviscapus，EB)又名燈盞細辛，為菊科植物短葶飛蓬的全草，為一種植物藥。目前的研究發現它能通過抑制氧化應激和增強機體的抗氧化作用來防治糖尿病腎病［2］。本實驗采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘發的大鼠糖尿病模型，用半定量反轉錄多聚酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)方法觀察其腎皮質RAGE mRNA的表達，旨在闡明燈盞花素對腎皮質RAGE mRNA表達的影響，以表明其對糖尿病腎病的防治作用，為DN的防治提供實驗依據和新的方法。

材料與方法

1．材料:選用浙江大學醫學院附屬第一醫院動物實驗室培育的Sprague－Dawley(SD)雄性大鼠。主要試劑有燈盞花素片(上海雷允上藥業有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。

2．方法:(1)動物模型的建立和分組 SD雄性大鼠27只，體重230～280g。隨機分為以下3組:正常對照組(C組)9只，糖尿病安慰劑組(D組)9只，糖尿病燈盞花素治療組(DD組)9只。飼養10天后禁食12h，D組和DD組予一次性腹腔注射65mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，C組予一次性腹腔注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液，72h后尾靜脈測血糖，以血糖 ＞16.7mmol/L確定為造模成功。其中DD組2只，D組1只血糖＜16．7mmol/L，3天后補注STZ(以15mg/kg體重劑量腹腔注射)，72h后測血糖＞16．7mmol/L。DD組每日給予燈盞花素混懸液［20mg/(kg·d)］灌胃。D組和C組每日給予同等劑量的生理鹽水灌胃。每隔2周稱體重測血糖1次。(2)RTPCR檢測腎皮質中RAGE mRNA的表達:①8周后，取腎皮質100mg提取RNA;②用紫外分光光度計測定RNA;③反轉錄合成cDNA;④PCR:分別進行RAGE及β－actin擴增;⑤PCR產物分析:取PCR產物5μl，上樣于瓊脂糖凝膠中，電泳至凝膠全長的2/3后，照相記錄。用G:BOX SYNGENE凝膠成像儀得電泳圖像。掃描特異性條帶的密度，取得光密度(optical density，OD)值。得出相對單位(相對單位=RAGE OD值/β－actin OD值)。

3．統計學方法:采用SPSS 16．0統計軟件進行統計分析，數據均行正態分布檢驗及方差齊性檢驗，正態分布數據用均值±標準差表示，3組間比較用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。p＜0．05表示有統計學意義。

結 果

3組大鼠成模時的體重無顯著性差異(P＞0.05);組間比較D組和DD組血糖同C組相比有顯著差異(p＜0．01)，DD組與D組間血糖無顯著性差異(P ＞0．05);而在成模2、4、6、8 周時，D 組和 DD 組與C組大鼠比較，體重、血糖均有顯著性差異(p＜0.01)，而D組和DD組之間體重、血糖無顯著性差異(P ＞0．05)(表1)。

表1 大鼠成模用藥后3組大鼠體重、血糖測定)

表1 大鼠成模用藥后3組大鼠體重、血糖測定)

與C組比較，*p＜0．01;D組老鼠有2只分別死于第5周及第7周

周數 組別 n 體重(g) 血糖(mmol/L)0 DD 9 297．86 ±42．95 27．77 ±3．46*D 9 295．44 ±13．11 30．23 ±3．06*C 9 302．00 ±14．37 5．62 ±0．24 2 DD 9 315．00 ±47．69* 31．11 ±4．03*D 9 285．11 ±14．72* 29．50 ±2．77*C 9 348．22 ±28．88 6．43 ±0．50 4 DD 9 310．86 ±49．10* 30．36 ±4．12*D 8 281．88 ±16．17* 32．20 ±2．59*C 9 388．89 ±36．78 5．95 ±0．42 6 DD 9 314．86 ±29．59* 31．65 ±1．46*D 8 298．84 ±23．04* 32．14 ±2．59*C 9 421．44 ±35．42 5．95 ±0．33 8 DD 9 291．00 ±30．19* 30．98 ±3．26*D 7 281．10 ±19．99* 31．30 ±1．52*C 9 453．31 ±50．53 6．28 ±0．40

實驗8周后，糖尿病大鼠腎皮質內RAGE表達較高與正常大鼠腎皮質內RAGE表達相比有顯著性差異(p＜0．01)。經燈盞花素治療后(DD組)RAGE mRNA的表達水平與D組相比有明顯降低，具有顯著性差異(p＜0．01)(表2)。3組大鼠腎皮質RTPCR產物瓊脂糖電泳(圖1)。

表2 各組大鼠腎皮質RAGE mRNA的表達

表2 各組大鼠腎皮質RAGE mRNA的表達

與C組比較，*P ＜ 0．01;與D組比較，▲P ＜ 0．01

組別 n RAGE OD值/β－actin OD值DD 9 0．452 ±0．208＊▲D 70．769 ±0．104*0．218 ±0．032 C 9

圖1 糖尿病大鼠腎皮質RT－PCR產物瓊脂糖電泳

討 論

在糖尿病病人中，持續性的高血糖及氧化應激使得蛋白質尤其是長效蛋白質如皮膚膠原蛋白廣泛被共價修飾從而加速了AGE的形成［3］。AGEs可通過多種病理機制參與糖尿病慢性并發癥的發生和發展。而受體介導的途徑是AGEs造成糖尿病慢性并發癥和心血管疾病的主要機制。在幾種不同的AGEs特異性受體中，研究最多、作用最明確的是RAGE。研究證實糖尿病動物的腎臟中檢測出AGEs顯著增加，給予正常小鼠AGE白蛋白后可以形成與糖尿病腎病相同的腎臟病變，而給予AGE形成抑制劑如氨基胍或RAGE特異性中和抗體則可以減輕這些改變。因此對AGE－RAGE途徑的抑制已成為治療糖尿病腎病的一個重要靶點［4，5］。本實驗結果顯示糖尿病組大鼠腎皮質中RAGE mRNA的表達比正常對照組明顯增高，具有顯著差異(p＜0．01)，這與國內外大量研究報道一致，進一步證實了糖尿病腎病的發生與RAGE所介導的組織損傷作用有關。

燈盞花素又名燈盞細辛，為菊科植物短葶飛蓬的全草，為一種植物藥，其有效成分為二咖啡酰奎寧酸，焦炔康酸，原二茶酸等黃酮類化合物［6］。燈盞花素除了其擴張血管，降低血液黏度，增加血流量，改善局部供血，減少血小板計數及抑制血小板積聚等功能對DN的防治有作用外，目前的研究還發現它通過抑制氧化應激和增強機體的抗氧化作用來防治糖尿病腎病。本實驗結果也顯示糖尿病大鼠腎皮質的RAGE mRNA表達明顯高于正常對照組(p＜0．01)，而用燈盞花素治療糖尿病大鼠8周后，與未治療的糖尿病大鼠相比RAGE mRNA的表達水平顯著降低(p＜0.01)。本實驗結果同時顯示燈盞花素對糖尿病大鼠的血糖無影響。所以燈盞花素降低RAGE在腎皮質的表達作用是獨立于降糖作用以外的，可能與其抑制氧化應激和增強機體的抗氧化作用，以及抑制血NF－κB及 TGF－β水平增加有關，為防治糖尿病腎病提供了新的方法。

1 Suzuki D，Toyoda M，Yamamoto N，et al．Relationship between the expression of advanced glycation end－products(AGE)and the receptor for AGE(RAGE)mRNA in diabetic nephropathy［J］．Intern Med，2006，45(7):435－441

2 馬麗，朱邦豪，陳健文，等．燈盞花素對糖尿病大鼠腎臟氧化應激的影響［J］．中國藥理學通報，2004，20(9):1030－1033

3 Jian GS，Mei FY，Xiao CC，et al．Effects of puerarin on receptor for advanced glycation end products in nephridial tissue of streptozotocininduced diabetic rats［J］．Mol Biol Rep，2009，36(8):2229 －2233

4 Flyvbjerg A，Denner L，Schrijvers BF，et al．Long－term renal effects of a neutralizing RAGE antibody in obese type 2 diabetic mice［J］．Diabetes，2004，53:166－172

5 Chuang PY，Yu Q，Fang W，et al．Advanced glycation endproducts induce podocyte apoptosis by activation of the FOXO4 transcription factor［J］．Kidney Int，2007，72(8):965 －976

6 Wang M，Xie C，Cai RL，et al．Studies on antioxidant activities of breviscapine in the cell－ free system［J］．Am JChin Med，2008，36(6):1199－1207