2型糖尿病的同型半胱氨酸及胱硫醚β合成酶CBS844ins68基因多態性特點

羅 丹 鄢盛愷 馬紅雨 程歆琦 宋耀虹

升高的血漿總同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是許多血管性疾病(如冠心病、腦卒中和進行性周圍血管病)的獨立危險因素，可用于獨立預測心腦血管事件發生的危險性。Hcy是甲硫氨酸轉甲基后生成的中間代謝產物，而前者又可在葉酸和VitB12輔助下再甲基化為甲硫氨酸或轉硫基生成胱硫醚。由此可知，葉酸和VitB12是Hcy代謝中重要的輔助因子，如果二者攝入不足，可能導致血中Hcy水平升高。除了上述營養因素，Hcy還受遺傳因素的影響，其代謝酶的基因突變引起的缺陷或活性下降也是導致Hcy升高的重要原因。胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)是Hcy代謝的關鍵酶之一。在CBS的催化下，同型半胱氨酸與絲氨酸結合生成胱硫醚。胱硫醚在γ-胱硫醚合成酶作用下裂解為半胱氨酸和α-酮丁酸。CBS缺乏或活性的降低，可導致Hcy升高。在1995年，Sebastio等發現一個同型半胱氨酸尿患者的一條等位基因的第8外顯子上發生了68個堿基的插入，此插入突變復制了第7內含子受體接縫處堿基，可產生兩種轉錄產物，其中一種含有T833C突變和一個提前出現的終止密碼子，該終止子可能導致編碼提前終結產生無功能的CBS酶［1］。由于不同研究對Hcy、葉酸、VitB12與糖尿病的關系的結論不一致，而且CBS844ins68基因多態性與糖尿病之間關系的報道也較少且存在很大差異，因此本實驗將對糖尿病患者的Hcy水平及CBS844ins68基因多態性特點進行研究。

對象與方法

1．研究對象:共納入155名無血緣關系的北方漢族人作為研究對象，其中72例新發糖尿病患者，選取在最近1年之內新近診斷糖尿病的患者，糖尿病的診斷標準:有典型糖尿病癥狀(多尿、多飲和不能解釋的體重下降)者+隨機血糖≥11．1mmol/L(200mg/dl)，或 FPG≥7．0mmol/L(126mg/dl)，或0GTT中2hPG≥11．1mmol/L(200mg/dl)。所有糖尿病患者均采用飲食或者藥物控制血糖，未使用胰島素治療，無CHD病史或其他任何疾病，男性34例，女性38例，年齡56．4±5．8歲(DM組);選取83例體檢中心體檢證實的健康正常人作為正常對照組，男性38例，女性45例，年齡56．0±5．8歲。

2．方法:①標本采集:禁食12～14h后清晨空腹采肘靜脈血，EDTA K3抗凝血3ml，抽血后立即離心分離，血漿-20℃凍存用于檢測Hcy、葉酸、維生素B12;白細胞層供提取基因組DNA，用于基因多態性的檢測;②標本的檢測:Hcy測定采用熒光偏振免疫法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，批號為43352HN00;葉酸、維生素B12測定采用微粒子酶免分析(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)，葉酸批號為51253M200，維生素B12批號為52380Q100。三者檢測試劑盒均由雅培公司提供;③CBS844ins68多態性檢測:采用根據鄢盛愷等建立的改良NaI法提取基因組DNA。檢測每位受試者的CBS844ins68位點的基因多態性［2］。下列引物根據參考文獻設計，正義鏈:5'-CTG GCC TTG AGC CCT GAA-3';反義鏈:5'-GGC CGG GCT CTG GAC TC-3'［3］。擴增體系包括:引物 0．4μmol/L，dNTP200μmol/L，10 × buffer 5μl，MgCl21．0mmol/L，Taq 酶 2．5U，基因組 DNA0．2μg，總體積 50μl。反應體系循環條件為94℃預變性5min，再進行以下循環:94℃1min，58℃ 1min，72℃ 1min，35 循環次，72℃ 延伸 5min。PCR產物直接進行電泳檢測鑒定。

3．統計學方法:本研究中Hcy、葉酸、維生素B12為均正偏態資料，以中位數表示，經對數轉換后均變為正態資料，兩組計量資料的統計經轉換后數據采用t檢驗，P值均為對數轉換后的P值。兩組基因型頻率及等位基因頻率比較采用χ2檢驗。以p＜0．05作為差異存在統計學意義的標準。采用SPSS 10．0軟件進行統計學分析。

結 果

1．糖尿病組與對照組Hcy、葉酸、維生素B12水平的比較:DM組Hcy水平明顯低于對照組(10．9μmol/L vs 12．7μmol/L，P ＜ 0．05)。DM 組葉酸水平明顯高于對照組(8．3ng/ml vs 5．5ng/ml，P ＜0．05)。DM組維生素 B12水平與對照組差異無統計學意義(396pg/ml vs 431pg/ml，P ＞0．05)(表1)。

表1 糖尿病組與對照組Hcy、葉酸、維生素B12水平(中位數)的比較

2．CBS844ins68基因型判定:CBS基因PCR擴增產物目的長度為184bp。存在CBS844ins68突變者可擴增出252bpDNA片段。CBS基因擴增結果見圖1。

圖1 CBS844ins68擴增后不同基因型電泳結果

3．兩組CBS844ins68基因型及等位基因頻率分布:兩組基因型頻率及等位基因頻率之間差異均無統計學意義(P均＞0．05)。兩組均未發現純合突變，且雜合頻率均較低。對照組CBS844ins68雜合頻率6．0%，糖尿病組 1．4%(表 2)。

表2 兩組CBS 844ins68基因型及等位基因頻率的比較

討 論

國內外對Hcy與糖尿病之間的關系報道不完全一致。周靈麗等研究表明糖尿病患者Hcy與正常對照組比較差異無顯著意義，與本研究結論不一致，可能與病例選取范圍有關，其研究的糖尿病患者范圍較廣，并沒有具體區分單純糖尿病組或糖尿病并發癥組［4］。陳先榮等［5，6］研究表明 2 型糖尿病的患者 Hcy濃度明顯高于對照組，亦與本研究結論不一致，原因可能在于除了病例選取范圍比較廣，而且患者年齡范圍亦比較廣(49～85歲)，另有研究表明Hcy與年齡具有顯著相關性，Hcy隨著年齡增加而增加，如果研究中患者年齡偏高也可能導致結果偏高。黃寧等［7］研究表明糖尿病無并發癥患者Hcy與正常對照組比較差異無顯著意義，與本研究結論亦不一致，可能由于其研究中無并發癥的糖尿病患者的病程較長均超過5年，而本研究均為最近1年之內新近診斷糖尿病的患者。Al-Nozah等［8］研究與本研究結論一致。本研究糖尿病組Hcy水平明顯低于正常對照組，可能由于選取的對象為新發糖尿病患者，無任何其他疾病或并發癥。本研究中糖尿病組葉酸水平比正常對照組顯著升高，可能與新發糖尿病的Hcy減低有關，前面的研究表明Hcy與葉酸水平顯著負相關［6］。

新發糖尿病Hcy減低的機制，不是十分清楚，可能與轉硫酶活性增強有關。一研究報道糖尿病鼠的Hcy水平明顯減低，肝臟的轉硫酶活性增強，經胰島素治療可使酶活性恢復正常從而調節Hcy的代謝［9］;另一項研究報道，糖尿病鼠的Hcy水平也明顯減低，肝臟的甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉移酶(BHMT)和CBS活性及其mRNA均增加［10］。

然而糖尿病隨著病程的增加，Hcy有可能因為腎臟功能損傷而增加。腎臟是Hcy代謝與清除的主要場所，含有Hcy再甲基化和轉硫基的多種酶系，約70%的Hcy從腎臟排泄。糖尿病患者隨著年齡增加，腎臟甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉移酶、胱硫醚合成酶、γ-胱硫醚酶等活性降低，腎小球濾過功能下降，被腎小管重吸收的Hcy在腎實質上皮細胞中的代謝減少，這些均會導致Hcy增加［11］。Hcy水平可能與糖尿病患者腎單位損傷的比例、腎臟損傷的進展程度以及胰島素抵抗等各種因素有關［12］。2型糖尿病患者個體在病程進展的不同階段，Hcy水平會發生變化，可以有不同表現。由此可見，不同的糖尿病研究的Hcy水平的結論不一致可能與病例選取中是否患有并發癥、病例的年齡、糖尿病的病程時間長短等因素均有關。

增加的Hcy可促進糖尿病冠心病以及糖尿病微血管病變的發生，其引起機體損傷的機制還不十分清楚，可能與以下因素有關:①氧化應激損傷;②誘導平滑肌細胞增殖;③糖尿病患者的LDL比非糖尿病患者的LDL更易發生同型半胱氨酸化，引起內皮細胞的毒性作用;④晚期糖基化終產物可能協同Hcy通過氧化應激途徑導致內皮損傷，加速動脈粥樣硬化的發展等［13～18］。

CBS 844ins 68的基因多態性進行分析的基本原理:CBS基因的8號外顯子的一個68bp的插入突變(CBS 844ins 68)導致了CBS基因多態性的產生，對不同個體的基因進行CBS844ins 68基因擴增，根據是否因插入突變從而得到不同長度的擴增片段，以此區分不同的基因型。Sebastio等認為此基因多態性產生了提前終止的密碼子，從而產生無功能的CBS酶［1］。不同的CBS基因型可能導致不同個體CBS的表達與功能上的差異，從而導致不同的生物學效應，因此此基因型可能作為基因背景，導致不同人群對于疾病具有不同的基因易感性以及不同的臨床特征。

本研究中兩組之間CBS844ins68基因型頻率及等位基因頻率的差異無統計學意義。兩組雜合頻率均較低，且均未發現純合突變。Tsai等報道CBS844ins68在美國正常人中雜合子較常見，頻率約為11．7%［3］。國內研究結果顯示正常對照組的CBS844ins68bp雜合子頻率為5．0%，與本研究結果類似。本研究與國外研究存在差異，可能與地域、遺傳、種族等因素有關。Sebastio等推測由于CBS844插入產生提前出現的終止密碼子，導致產生縮短的蛋白質即無功能的 CBS 酶［1］。而 Tsai等［3］報道CBS844ins68插入并沒有導致同型半胱氨酸血癥。Summers等研究亦表明 CBS844ins68可使 MTHFR 677TT者的Hcy與葉酸水平趨向正常。不同研究對CBS844ins68功能結論不一致，有待擴大樣本量、選取特定人群進一步研究證實。

本研究結果表明新發2型糖尿病患者Hcy水平可能減低，但也應監測Hcy水平，防止Hcy可能在不同病程對患者造成的損傷，進一步的研究應區分不同病程，不同年齡，根據不同Hcy水平，進行補充葉酸或維生素等試驗，對糖尿病患者進行個體化治療，盡量減少高Hcy血癥對糖尿病患者的損傷防止并發癥的發生。CBS844ins68基因多態性可能與中國北方漢族人糖尿病無關。

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