實時熒光定量PCR方法對3種不同標本中巨細胞病毒檢出率的比較

余鵑春 王 左 項貴明 吳佳燕

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)屬于皰疹病毒科β屬，是一種有包膜的雙鏈線性DNA病毒，直徑大約 200nm，基因組長約 220～245kb，是人類先天性病毒感染的主要病原，同時也是機體免疫功能低下的人群的常見并發感染的死亡原因，如器官移植以及AIDS病人［1］。CMV感染所致疾病癥狀和體征等表現是非特異性的，許多CMV感染的病人并不表現出臨床癥狀成為潛在感染狀態，必須結合實驗室診斷才能診斷［2］。實時熒光定量PCR是一種早期快速的診斷方法，目前臨床主要使用血清標本檢測，但檢出率太低，筆者醫院2008～2009年1年間共申請檢查HCMV－DNA血清標本810例，檢出14例陽性標本，其中腎移植術后8例，血液科5例，呼吸科1例，檢出率僅為1．7%，為此筆者對膠體金標免疫層析法檢測HCMV－IgM陽性或弱陽性的患者，分別留取血清、晨尿沉渣及外周血中單個核細胞3種臨床易獲標本，采用實時熒光定量PCR同時進行檢測，以期獲得一種更適合臨床需要的檢測標本。

對象與方法

1．研究對象:筆者醫院2009年11月～2010年3月HCMV－IgM陽性或弱陽性的患者43例，分別收集這些患者的血清，晨尿和外周血中單個核細胞液標本。同一病人具備3種標本的21例，共有血清標本42例，外周血單個核細胞分離標本43例，尿沉渣標本22例，其中腎移植術后30例，血液科7例，兒科4例，神內皮膚科2例。女性16例，男性27例;患者年齡最小2個月，最大70歲，中位平均年齡36．7歲。

2．標本的采集和處理:在患者知情同意下，用促凝管采集被檢者靜脈血3ml，4000r/min離心分離血清。收集被檢者中段晨尿10ml密封送檢，混勻取1ml尿液標本于1500r/min離心10min，棄掉上清，其沉渣用于HCMV－DNA的提取。用被檢者靜脈血3ml(EDTA抗凝)，使用上海華精生物公司的Ficoll分離液，嚴格按說明書要求操作，分離提取外周血單個核細胞。

3．HCMV－DNA測定:采用實時熒光PCR方法。試劑盒由深圳匹基公司提供，批號:090801。①標本的提取:取100μl待測標本，加入100μl DNA提取液1(PEG，NaCl)，振蕩混勻。13000r/min離心15min，吸棄上清。加入50μl DNA提取液2(Tris．base，KCl，NP40)，振 蕩 混 勻。100℃ 干 浴 10min，13000r/min離心10min，保留上清待用;②擴增條件設置:37℃:5min;94℃:1min;95℃:5s，60℃:30s，40 個循環。試劑使用TaqMan探針，熒光信號收集選擇FAM檢測通道，熒光信號收集選擇在60℃;③結果判斷:嚴格按照試劑說明書進行。定性判斷標準:CT值≤37．0的樣本為陽性;④擴增儀器:基因公司RG3000熒光PCR檢測儀。

4．HCMV－IgM測定:膠體金標免疫層析試驗。使用康華生物技術有限公司TOCRCH－IgM試劑。

5．統計學方法:3種不同標本中檢出率的比較采用χ2檢驗，以p＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

Real－time PCR擴增曲線見圖1、圖2;擴增結果見表1、表2(S:血清;U:晨尿;M:外周血單個核細胞)。

Real－time PCR檢測3種不同標本中HCMVDNA結果見表3。表3中數據顯示，患者外周血單個核細胞分離液標本陽性檢出率20．93%，晨尿沉渣標本HCMV－DNA陽性檢出率為18．18%，都顯著高于血清標本陽性檢出率4．76%。

表3 實時PCR檢測不同標本中HCMV－DNA結果比較

討 論

目前用實時PCR檢測HCMV的臨床標本可以有以下幾種標本:血清、尿液、外周血單個核細胞分離液、羊水、乳汁，支氣管肺泡灌洗液，腦脊液等［3，4］。至今以何種標本作為臨床常規檢查標本仍有爭議，因羊水、乳汁等臨床標本數量較少，單從本文所選3種標本檢出率來看，外周血中分離的單個核細胞檢出率最高、其次是尿液、目前臨床開展最廣泛的血清檢出率是最低的。

HCMV主要侵襲血液有核細胞并在細胞內潛伏或增殖，同時提取外周血中單個核細胞經過了離心濃縮過程，相對提高了病毒濃度，故外周血中單個核細胞檢出率高，但由于其操作程序復雜，且受白細胞數量影響較大，對于骨髓移植術后早期白細胞缺乏或使用抗病毒藥物影響白細胞數量低時檢測將受到限制［5］。劉廣印等［6］提出用 NH4Cl裂解紅細胞代替淋巴細胞分離液，此法簡便易操作，結果可靠，特別適用于常規實驗室應用，可向臨床實驗室推薦使用。

HCMV最易侵犯管道上皮細胞，尤其是腎臟及肝膽系統。CMV在腎小球和腎小管上皮細胞內復制，經尿液排出，因此可在尿液中檢測，檢出陽性率高［7］。尿液標本中HCMV量可很好反映機體內HCMV病毒量，且取材方便、無創、易為患者接受。對需長期監測HCMV病毒載量的移植病人和小兒患者為最適用標本，不失為理想的臨床檢測標本。但尿液存在取材可能被污染和CMV感染治愈后仍有排毒現象，易造成假陽性。

HCMV感染機體，侵入細胞后開始增殖，增殖一定程度后可誘發宿主細胞發生凋亡，同時釋放出宿主細胞里的病毒，血清里的病毒達到一定數量之后，我們才能檢測到血清里的巨細胞病毒，故血清檢出率較低。但血清標本的檢出能比較好的反映感染的活動性，且有統一的參考范圍，可以對疾病有良好的評價。

綜上所述，外周血中單個核細胞的HCMVDNA檢出率高，檢測結果穩定特異，是理想的臨床檢測標本，同時晨尿沉渣也因其陽性率較高、取材方便、無創、易為患者接受等，也可根據患者情況予以選擇，但二者的參考區間是否與血清一致，還有待進一步研究。

1 Soderberg NC．HCMV microinfections in inflammatory diseases and cancer［J］．J Clin Virol，2008，41(3):218 － 223

2 張書紅．人巨細胞病毒感染檢測方法的研究進展［J］．醫學綜述，2009，15(22):3495－3497

3 Murata H，Nii R，Ito M，et al．Quantitative detection of HCMV － DNA in saliva from infants and breast milk on real－time polymerase chain reaction［J］．Pediatr Int，2009，51(4):530 －534

4 Xue W，Liu H，Yan H，et al．Methodology for monitoring cytomegalovirus infection after renal transplantation［J］．Clin Chem Lab Med．2009，47(2):177 －181

5 陳俊青，劉霆．巨細胞病毒感染檢測方法的現況和進展［J］．中國輸血雜志，2005，18(5):428 －431

6 劉廣印，周光庭，沈佐君．實時熒光定量PCR檢測巨細胞病毒兩種白細胞提取方法對比分析［J］．淮海醫藥，2007，5(2):95－96

7 Bergallo M，Costa C，Terlizzi ME，et al．Reverse transcriptase－ polymerase chain reaction to evaluate human cytomegalovirus lytic gene expression［J］．Mol Biotechnol，2008，40(2):144 －150