siRNA－Gli－1聯合BCNU抑制膠質瘤細胞U251增殖

田海龍，李惠武，李 卉，段明軍，姜孝芳，白靖平*

(新疆醫科大學1.附屬腫瘤醫院;2.基礎醫學院細胞與分子生物教研室;3.第一附屬醫院醫學中心，新疆烏魯木齊830000)

神經膠質瘤的發病率占原發顱內腫瘤第1位。臨床針對膠質瘤進行手術輔助放化療的綜合治療，但治療效果并不理想。近年來發現Hedgehog(Hh)信號通路的異常激活在膠質瘤的發生發展中起重要作用。該通路通常通過核轉錄因子Gli-1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli-1)發揮作用。Gli-1成為Hh信號最終的響應者和功能的執行者，其核酸水平的表達是Hh通路早期活化的標志，是整個通路最主要的環節［1－2］，Gli-1的異常高表達可能促進膠質瘤發生和發展。

卡莫司汀(carmustine，BCNU)是治療腦腫瘤常用的藥物之一，但靜脈注射該藥對骨髓、肝臟和肺臟的不良反應大，限制藥物的臨床應用［3］。為探索更理想的膠質瘤治療方法，本研究觀察siRNA聯合BCNU影響膠質瘤細胞凋亡和增殖的作用效果，探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質瘤U251細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所);RPMI1640和胎牛血清(Gibco公司);反轉錄試劑盒及Trizol(Invitrogen公司);AnnexinⅤ凋亡試劑(上海晶美公司);siRNA和脂質體LipofectamineTM2000(上海吉瑪公司);兔抗人 Gli-1、BCL-2、cycinD1和BAX多克隆抗體(武漢博士德公司);Western blot試劑盒及碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)(Sigma公司);BCNU注射液(上海伊明公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞系培養:含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%滅活胎牛血清的RPMI1640作為培養基，復蘇U251膠質瘤細胞，5%CO2、37℃培養，2～3 d傳代1次。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 siRNA-Gli-1合成、轉染及濃度篩選:根據人Gli-1序列(Genbank，NM_00116 0045)中轉錄RNA的作用位置及小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)設計原則，確定人Gli-1的siRNA目標寡核苷酸序列，由上海吉瑪公司設計并合成針對Gli-1的siRNA干擾片段(Gli-1-siRNA)和陰性對照siRNA(negative control siRNA，NC)，綠色熒光素酶(FAM)標記(FAM-siRNA)。設siRNA-Gli-1不同濃度梯度10、50、100 nmol/L各3個復孔，重復6次，收集轉染6 h后的U251細胞，倒置熒光顯微鏡觀察，流式細胞儀檢測轉染效率，篩選siRNA-Gli-1最佳濃度。

1.2.3 轉染后細胞形態學的觀察:將對數生長期的U251細胞隨機分為3組:siRNA-Gli-1組(篩選后的siRNA-Gli-1干擾片段);空轉組(Lipofectamine，lipo group);空白組 (RPMI1640 group)作為對照，250μL PRMI1640稀釋的 siRNA-Gli-1，同 Lipofectamine混勻，室溫下保溫孵育20 min，轉染細胞，光鏡觀察。

1.2.4 反轉錄聚合酶鏈反應(半定量PCR)檢測轉染及 BCNU處理后 Gli-1、cyclin D1、BCL-2和 BAX mRNA水平的表達:隨機分組如下:BCNU組(BCNU注射液，預實驗確定濃度為1.5 mg/L)、siRNA-Gli-1組、聯合組(combination group，siRNA-Gli-1+1.5 mg/L BCNU)、空轉組和空白組。所有引物(表1)均由上海生工公司合成。PCR產物用1×TBE電泳緩沖液的2%(W/V)瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L的溴乙錠)電泳，紫外線投射反射儀下觀察結果，凝膠圖像分析儀掃描。

1.2.5 Western blot檢測轉染及BCNU處理后Gli-1、cyclin D1、BCL-2及BAX蛋白的表達水平:分組同1.2.4，細胞轉染48 h后提取總蛋白，經Bradford法測定蛋白濃度，蛋白質等量樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液混合，煮沸變性5 min;上樣蛋白為60μg，每組分別取20μg用以檢測內參GAPDH蛋白質，取60μg用以檢測Gli-1蛋白質，經12%SDS-PAGE電泳，30 V 4℃電轉移過夜轉至硝酸纖維素 (NC)膜;麗春紅S染色10 min以觀察各電泳帶蛋白質量是否一致;4℃封閉過夜;洗膜30 min，加入用TBS稀釋的一抗 (1∶50)，GAPDH(1∶400)4℃孵育8 h;洗膜30 min，羊抗兔IgG抗體 (1∶6 000)室溫共孵育4 h，洗膜30 min;加入ECM試劑，曝光，顯影，定影，X線膠片拍照保存。

1.2.6 流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測細胞凋亡及細胞周期:分組同1.2.4，消化細胞，并及時加入含血清的完全培養基終止反應。輕微吹打使細胞脫壁，500 r/min離心5 min收集細胞，棄上清，洗滌2次。懸浮細胞得單細胞懸液，加入純乙醇，終濃度達70%以固定細胞，置4℃過夜。離心棄乙醇，再洗滌細胞2次;加碘化丙啶染色液30μL，15 min。流式細胞儀測定細胞凋亡百分比及周期。

1.2.7 甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT法)檢測細胞增殖 分組同1.2.4。取對數生長期細胞，制成單細胞懸液，調整濃度至105/mL，按2×104/孔接種于96孔培養板中，終體積200 μL/孔，設6 個復孔，分別于轉染后12、24、48 和72 h加人20μL MTT(5 g/L)/孔，繼續培養4 h棄上清，加二甲基亞砜150μL，室溫靜置20 min，振蕩10 min至紫色結晶完全溶解，酶標儀490 nm波長處測各孔吸光度值。實驗重復6次，繪制細胞增殖曲線。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞形態學改變與篩選結果

當lipofectamine∶siRNA干擾片段 =50 pmol∶5μL轉染后，倒置熒光顯微鏡觀察，從2 h開始，細胞發出綠色熒光，6 h視野滿布熒光細胞(圖1A)。經FCM檢測，siRNA-Gli-1和NC轉染的效率約為69.20% ～73.80%，因此后續實驗均按此比例進行。光鏡下觀察，空白組和空轉組的U251細胞均貼壁生長，梭形或多角形，有突起;細胞均勻分布，胞膜有良好的折光性;siRNA-Gli-1組的細胞在24 h出現死亡，48 h死亡細胞明顯增加(圖1B)。

表1 各待測因子引物序列、擴增長度及擴增條件Table 1 The primer sequences，the length and condition of amplification of each factors

2.2 U251細胞中 Gli1、cyclin D1、BCL-2及 BAX的mRNA和蛋白水平表達

各組中Gli-1蛋白同mRNA表達水平基本一致(圖2)。各組中BCL-2、BAX及cyclin D1蛋白表達具有差異(圖3)。

圖3 Western blot檢測各組Gli-1、BCL-2、BAX和Cyclin D1蛋白的表達Fig 3 Detection of protein expressio of Gli-1，BCL-2，BAX and Cyclin D1 in different groups

2.3 siRNA-Gli-1聯合BCNU對U251細胞凋亡的影響

處理48 h后，siRNA-Gli-1組、BCNU組、聯合組與空轉組和空白組之間有顯著差異(p＜0.01);siRNA-Gli-1組與BCNU組和聯合組之間有顯著差異(p＜0.05)BCNU組與聯合組之間有顯著差異(p＜0.05)(圖4)。

2.4 細胞周期分析結果

空白組和空轉組細胞的G1期百分比含量明顯低于其他3個實驗組;細胞的S期百分比含量與此相反(p＜0.01)(表2)。

圖4 轉染和BCNU處理48 h后各組細胞凋亡檢測Fig 4 Detection of cells apotosis in each group 48 hours after transfection and being treated by BCNU

表2 各組在不同細胞周期時段的細胞含量Table 2 The cell contents in different phases in different group

2.5 U251細胞增殖抑制率檢測結果

MTT法顯示12 h開始，空白對照組、空轉組A值逐步升高、24 h后升高明顯;siRNA-Gli-1組、BCNU組和聯合組48 h后緩慢升高。與空白及空轉組對比，siRNA-Gli-1 組、BCNU 組和聯合組 12、24、48、72 h細胞生長抑制率均隨時間的延長而顯著升高，24～72 h內，聯合組細胞生長受抑制最明顯(p＜0.05)(圖4)。

圖5 各組細胞增殖檢測結果Fig 5 Detection of cells proliferation in each group on different times by MTT

3 討論

Gli-1異常激活，調控下游靶基因的異常轉錄，對膠質瘤的發生和惡性生物學特性的維持極為重要［4－5］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是目前干擾基因表達研究的熱點，其核心是由21～25 nt雙鏈RNA介導的序列特異性轉錄后的基因靜默過程［6］。本研究將siRNA-Gli-1轉染于人膠質瘤U251細胞，沉默Gli-1表達，抑制細胞增殖，細胞凋亡增加。在此基礎之上，聯合化療藥物BCNU，觀察對U251細胞增殖及相關因子表達的影響。BCNU不抑制Gli-1的表達，但是BCNU和siRNA-Gli-1都使得BCL-2表達降低，BAX表達上調，BCL-2/BAX比例下降。二者聯合，這一作用增強(p＜0.05)。研究證實，BCNU作為細胞周期非特異性烷化劑，具有誘導細胞凋亡的作用，作用機制是通過影響caspase 3通路改變BCL-2和BAX的表達［3］。本研究發現，Gli-1轉錄受到RNAi干擾后，BCL-2/BAX比例改變，造成腫瘤細胞凋亡逃逸機制失調，對BCNU的敏感性增加，促使凋亡率增高［7－8］。流式細胞檢測結果顯示，siRNA-Gli-1組、BCNU組、聯合組增加U251細胞凋亡比例，聯合組促進凋亡的效果更為明顯(p＜0.05);同BCL-2/BAX表達的變化一致;細胞增殖的程度受Gli-1表達的影響，靶向Gli-1的siRNA-Gli-1，具有抑制膠質瘤U251細胞增殖和促進凋亡的作用。Gli-1調控BCL-2的表達，影響U251細胞增殖和凋亡;細胞增殖曲線顯示，siRNAGli-1和BCNU聯合顯著增加單用BCNU或siRNAGli-1對U251細胞的抑制程度(p＜0.05)，其抗腫瘤作用可能通過增強腫瘤細胞的促凋亡和抑制抗凋亡基因的表達雙重機制來實現的。

作為調節G0/G1期的細胞周期相關蛋白，cyclin D1在膠質瘤中過表達，與腫瘤增殖和侵襲密切相關［9］。過表達cyclin D1使G1期縮短，對分裂原的依賴性減弱，并異常啟動S期相關基因的轉錄，加速細胞分裂或轉化［9－10］。siRNA-Gli-1 通過干擾Gli-1的轉錄導致cyclin D1表達下調，抑制細胞進入S期從而延緩細胞增殖。沒有發現BCNU促進siRNA-Gli-1下調cyclin D1表達的證據，但是siRNA-Gli-1和BCNU聯合對細胞周期抑制效果增強。是Hh和caspase-3信號通路表達共同增強的結果，還是有其他通路的參與?具體機制不清楚，需進一步探討。

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