TPX2在宮頸癌中的表達及意義

常海平，王敬芝，田 原，徐 杰，程建新*

(1.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北石家莊050011;2.內蒙古醫學院第一附屬醫院婦產科，內蒙古呼和浩特010059)

TPX2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2)，是一個受細胞周期嚴格調控并在細胞有絲分裂紡錘體形成過程中發揮重要作用的微管相關蛋白［1］。近年有研究者發現其過表達與唾液腺癌［2］肺鱗癌［3］、乳腺癌［4］、口腔鱗癌［5］等的發生發展有關。降低其表達可抑制腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤治療的候選靶點［6］。

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展和轉歸與多種因素有關，TPX2是否參與其中，目前國內外尚未見報道。本研究探討TPX2在子宮頸癌中的表達情況及其與子宮頸癌臨床分期、分化程度及淋巴結轉移的關系，為宮頸癌的診治提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本

收集河北醫科大第四醫院2009－2010年資料完整的手術切除的宮頸癌標本79例，新鮮的宮頸癌組織，取材后迅速放入液氮灌中，保存于－80℃冰箱，所有標本均經病理證實。宮頸癌患者年齡30～72歲，中位年齡49.5歲。鱗癌標本62例，組織學分級:Ⅰ級27例、Ⅱ級16例、Ⅲ級19例;腺癌17例，其中病理分級Ⅰ級11例，Ⅱ級5例，Ⅲ級1例。臨床分期:Ⅰ期39例，Ⅱ期36例，Ⅲ期4例。其中淋巴結轉移組17例，無淋巴結轉移組62例。宮頸上皮內瘤變 (CIN)組30例，取自病理科存檔蠟塊。年齡34～57歲，中位年齡45歲，其中CINⅠ8例，CINⅡ13例，CINⅢ9例。對照組:因子宮肌瘤作全子宮切除的正常宮頸組織15例，年齡37～65歲，中位年齡52歲，所有腫瘤標本均在患者放、化療治療前采集并獲得患者的知情同意。

1.2 試劑

兔抗人TPX2多克隆抗體(Bioward公司)，SP試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，引物由上海捷瑞技術有限公司設計，Trizol試劑(Invitrogen公司)，反轉錄系統試劑盒(Fermentas公司)。宮頸腺癌HeLa細胞系(河北醫科大第4醫院科研中心細胞庫)，宮頸鱗癌Siha細胞(上海中科院細胞庫)，1640細胞培養基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季清公司).

1.3 細胞培養

HeLa、Siha細胞分別培養于含10%FBS的RPMI1640培養基中，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，待細胞匯合至基本鋪滿瓶底時傳代。

1.4 RT-PCR方法

取100 mg組織及已鋪滿25 cm2培養瓶的細胞，采用Trizol總RNA提取液提取總RNA，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性，以DNA/RNA測定儀260/280 nm波長處測定RNA的吸光度(A)值，以測定RNA樣品的純度和濃度。cDNA的合成按反轉錄試劑盒說明書進行，1μL Oligo d(T)、2μg總RNA和1μL 10 mmol/L dNTP混合物加入滅菌蒸餾水至12μL，65℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。加入4μL 5×反應緩沖液和2μL 0.1 mmol/L DTT離心后37℃下孵育2 min，在室溫下加入1μL M-MLV，37℃孵育50 min，70℃加熱15 min以終止反應。最后于－20℃保存待用。PCR擴增:采用GAPDH作為內參照，目的片段為247 bp，引物序列為;5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'(上游)，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(下游)。TPX2目的片段為332 bp，序列為:5'-AACAATCCATTCCGTC AA-3'(上游)，5'TGCAGGTGGCATACAAGG-3'(下游)。PCR擴增:TPX2反應條件為:95℃變性3 min后，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35 個循環，最后72℃延伸6 min。GADPH為95℃變性5 min后，95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共25 個循環，最后72℃延仲6 min。PCR反應產物置于1.5 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳(80 V，40 min)，采用凝膠成像分析系統對條帶進行掃描分析TPX2及GADPH的吸光度值。TPX2的表達量以其 A值與同一標本GADPH的A值的比來表示。

1.5 免疫組化檢測及結果判定

采用免疫組化SP法檢測:用PBS液(磷酸鹽緩沖液)取代第一抗體作陰性對照。實驗操作按SP試劑盒說明書進行。切片常規脫蠟，高壓鍋130℃修復13 min，3%H2O2作用15 min消除內源性過氧化物酶，正常山羊血清37℃封閉30 min，滴加TPX2一抗(1∶75)，4℃過夜，37℃孵育30 min，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，滴加三抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，封片。免疫細胞化學步驟:細胞爬片不進行高壓修復，其余同免疫組化。結果判斷:根據染色陽性細胞數和染色強度綜合評定。TPX2的陽性表達定位于胞核。隨機選擇5個高倍視野，每個視野計數100個瘤細胞，計數陽性細胞百分比。無染色計0分;弱染色(淺黃色)計1分;中等染色(棕黃色)計2分;強染色(黃褐色)計3分，細胞陽性率≤5%計0分，5%～25%計1分，25% ～50%計2分，＞50%計3分。上述二項相加，0分為陰性(－)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。

1.6 統計學分析

采用SPSS13.0統計學軟件，其中免疫組織化學染色結果為等級資料采用秩和檢驗分析，RTPCR結果采用均數±標準差 (x—±s)表示，各表達指標的組間差異在進行方差齊性檢驗后，進行t檢驗分析。

2 結果

2.1 TPX2的RT-PCR檢測

正常宮頸組織中TPX2的mRNA幾乎不表達為0.080±0.030，而宮頸腺癌組織中TPX2 mRNA表達為0.467±0.031，宮頸鱗癌組織TPX2 mRNA表達為0.441±0.011，HeLa細胞的表達為1.923±0.040，Siha細胞的表達為1.679±0.042，各組與正常宮頸組織比較均有明顯差異(p＜0.01)，(圖1)。

2.2 免疫組化法檢測TPX2蛋白在不同宮頸組織及細胞中的表達

TPX2蛋白在不同宮頸組織的表達 (表1)，TPX2蛋白表達定位于胞核，TPX2蛋白在CIN和宮頸鱗癌組織中表達漸增強 (圖2A，圖2B)，但在正常宮頸鱗狀上皮未見表達 (圖2C)，p＜0.05，宮頸腺癌組織呈陽性表達 (圖2D)，正常宮頸腺上皮未見表達 (圖2E)。TPX2蛋白均表達于細胞核，宮頸腺癌HeLa細胞系的表達強于鱗癌Siha細胞系 (p＜0.05)(圖3)。

表1 TPX2蛋白在不同宮頸組織的表達Table 1 Expression of TPX2 protein in different cervical tissue

2.3 TPX2蛋白在宮頸癌的表達與臨床病理參數之間的關系(表2)

TPX2蛋白在宮頸癌中，隨著病理分級增加其表達增強，中低分化的表達強于高分化(p＜0.05)，臨床分期Ⅱ，Ⅲ期強于Ⅰ期(p＜0.05)，有淋巴轉移組強于未有淋巴轉移組(p＜0.05)。尚不能證明表達強度與年齡有關系(P＞0.05)。

3 討論

圖1 TPX2 mRNA在宮頸癌組織和宮頸癌細胞系中的表達Fig 1 The expression of TPX2 mRNA in cervical cancer Cell lines and cervical cancer tissue

圖2 TPX2蛋白在不同宮頸組織的表達Fig 2 Expression of TPX2 protein in different cervical tissue(×400)

表2 TPX2與宮頸癌各臨床病理因素的關系Table 2 Correlation of TPX2 expression to clinicopathologic factors of cervical carcinoma

圖3 TPX2蛋白在不同宮頸細胞系中的表達Fig 3 Expression of TPX2 protein in different cervical cancer cell lines(×400)

TPX2是一種受細胞周期嚴格調控的核增殖相關蛋白，參與細胞有絲分裂的紡錘體微管功能，它在細胞有絲分裂紡錘體的組裝時發揮重要的作用，在組裝完成后它又在維持紡錘體的完整性方面起作用［1］。它主要表達于 S期，其次是 G2期和M 期［7］。有研究者認為它在肺癌進展中起致癌作用，表達強度與肺鱗癌的臨床分期、病理分級以及是否有淋巴轉移相關，其高表達與5年生存率的降低相關［3］。有人用RNA干擾方法抑制TPX2的表達后致細胞增殖能力降低及發生S期細胞周期停頓現象和細胞凋亡［6］。有研究者利用 RNA干擾技術靶向抑制TPX2用以治療小鼠胰腺癌取得了滿意的效果［8］，本研究我們發現，TPX2在宮頸腺癌HeLa細胞中表達極高，宮頸鱗癌Siha細胞中的表達略弱于HeLa細胞，TPX2是否在腺癌的進展中發揮更重要的作用，還有待于進一步研究。TPX2在正常宮頸腺上皮和鱗狀上皮均不表達，而在鱗癌和腺癌組織中卻明顯呈陽性表達，而且隨著腫瘤分期越晚及組織病理學分級越差，TPX2蛋白的表達水平越高。TPX2蛋白的表達水平在是否有淋巴轉移的兩組中有顯著性差異，提示該蛋白是宮頸癌淋巴轉移的危險因素，其高表達可能成為研究宮頸癌淋巴轉移新的分子標志。在正常宮頸鱗狀上皮、CIN、宮頸鱗癌組織中，TPX2蛋白由不表達到表達遞增趨勢，提示TPX2可能在宮頸癌發生過程中起重要的促進作用，監測其表達可能成為宮頸癌及宮頸癌前病變的一種輔助診斷指標。以TPX2為研究點，可能為宮頸癌的診治提供一條新的思路。

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