內臟高敏感大鼠結腸Cajal間質細胞C-KIT表達增加

丁瑞峰，王愛魚，王宏杰，郭元虎，趙鵬程

(包頭醫學院第一附屬醫院消化科，內蒙古包頭014010)

功能性胃腸病(functional gastrointestinal disorders，FGIDs)是以消化系統癥狀為臨床表現，而應用生化、影像學和內鏡檢查等并未發現器質性病變的一類胃腸道疾病［1］。認為其發病與內臟感覺、炎性反應、腸神經系統甚至中樞神經系統調節功能等因素有關，而內臟高敏感是功能性胃腸病癥狀產生的主要原因之一。Cajal間質細胞(interstitial celIs of cajal，ICC)被認為是胃腸慢波的起搏細胞，是調節胃腸運動的重要環節［2］。本研究通過直腸注射冰醋酸建立內臟高敏感大鼠模型［3－4］，探討ICC在內臟高敏感中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級新生Wistar大鼠［內蒙古大學實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(蒙)2007-0001］，每8～10只與其母鼠共同飼養在同一箱內，發育至25 d后，將母鼠與幼鼠分離。分離后的大鼠雌雄分離，每4只∕籠，給予足夠的食物、水。所有大鼠均在安靜室溫下飼養，晝夜控制為12 h周期。C-KIT一抗和 β-actin為兔多克隆抗體(武漢博士德公司)，二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立:參照文獻［3－4］，新生大鼠16只隨機分為2組，對照組大鼠自出生后8～21 d每日上午將石蠟油潤滑后的連續硬膜外導管(直徑1.0 mm)緩慢經肛門插入0.5～1.0 cm，注入0.9%氯化鈉注射液0.3～0.5 mL，實驗組注入0.6%冰醋酸溶液0.3～0.5 mL。從第21天后不進行任何實驗操作。

1.2.2 腸道敏感性評估:8周齡時行直腸擴張(colorectal distention，CRD)，觀察大鼠腹部撤離反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分。清醒狀態下，將石蠟油潤滑后的8F導尿管經肛門插人，氣囊末端距離肛門1.0 cm。用膠布把導管和大鼠尾巴根部纏在一起，固定氣囊，將其放在特制的透明塑料籠(20 cm×8 cm×8 cm)內，大鼠在此籠內只能前后運動，不能轉身。大鼠適應環境20 min后，進行直腸擴張。導管球囊內快速注人0.9%氯化鈉注射液，觀察大鼠腹部撤離反射為3分時的注水量(腹背部肌肉較強收縮并把腹部抬離地面)。每次直腸擴張持續20 s，間隔3 min，重復進行3次，數據取均值。

1.2.3 取材:對大鼠進行評分后，予5%戊巴比妥過量麻醉處死。剖腹手術分離遠端結腸，切除降結腸組織2.0 cm，一部分標本液氮冷凍過夜后－80℃冰箱保存，一部分標本置入4%多聚甲醛液24 h固定，石蠟包埋，制成5μm厚的切片，貼在經APES處理的載玻片，37℃溫箱烘干備檢。

1.2.4 免疫組化:石蠟切片梯度脫臘，0.3%甲醇-H2O2室溫孵育，封閉內源性過氧化物酶;0.01 mol/L PBS漂洗，抗原修復標本于檸檬酸緩沖液微鍋爐加熱，1%山羊血清封閉背景，吸去多余血清;加1∶50 C-KIT一抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗;1∶100生物素標記的羊抗兔 IgG，室溫孵育2 h，PBS漂洗;新鮮配制DAB溶液顯色，DPX封片。顯微鏡下胞質出現棕黃色片狀或顆粒狀物為C-KIT陽性反應，每例取3張切片，每張切片取5個高倍鏡視野下的陽性細胞計數，取其平均值計算均數及標準差。

1.2.5 蛋白印跡法:提取蛋白樣品80μg，SDSPAGE凝膠電泳分離，凝膠電泳儀初始電壓80 V，后提高電壓至100 V，用PVDF膜進行蛋白質的電轉移，用5%TBS-T脫脂奶粉封閉。用TBS-T漂洗液洗膜，加入用適當漂洗液稀釋的抗體(C-KIT為1∶200;β-actin 為1∶5 000)，4 ℃ 孵育過夜。TBS-T漂洗液洗膜3次，然后將PVDF膜移入另一新的雜交袋，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(C-KIT 為1∶2 000;β-actin 為1∶10 000)，37 ℃ 振蕩60 min，TBS-T漂洗液洗膜。加入化學發光劑曝光、顯影。蛋白圖像分析用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進行吸光度分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 AWR評分

實驗組大鼠AWR為3分時的注水量為(1.37±0.31)mL，顯著低于對照組的(1.84±0.22)mL(P ＜0.05)。

2.2 C-KIT陽性細胞染色和C-KIT蛋白印跡

對照組與實驗組結腸組織中C-KIT陽性細胞分布、形態相似。主要分布在黏膜下ICC(ICC-SM)和肌間神經叢ICC(ICC-MY)，在環肌層和縱肌層內ICC(ICC-IM)也有分布。正常ICC多呈紡錘形，有2～5條長突起。實驗組大鼠結腸組織中C-KIT陽性細胞數顯著高于對照組(p＜0.05)(圖1，表1)。實驗組大鼠結腸組織中C-KIT蛋白表達明顯高于對照組(P ＜0.01)(圖2，表1)。

圖2 Western blot檢測大鼠結腸C-KIT蛋白表達Fig 2 Expression of C-KIT protein measured by Western blot in rat colon

3 討論

圖1 大鼠結腸C-KIT免疫組化Fig 1 C-KIT immunohistochemistry staining of colon of rats(×400)

表1 對照組和實驗組C-KIT陽性細胞計數和蛋白吸光度值比較Table 1 Comparison of C-KIT masculine cell counting and C-KIT protein absorbance value of control group and model group，n=8)

表1 對照組和實驗組C-KIT陽性細胞計數和蛋白吸光度值比較Table 1 Comparison of C-KIT masculine cell counting and C-KIT protein absorbance value of control group and model group，n=8)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 compared with control group．

group C-KIT masculine cell counting C-KIT pro tein A value control 15.33±1.57 40.6±30.5 model 23.37±1.88* 134.5±47.5＊＊

內臟高敏感表現為患者對胃腸刺激的疼痛閾值降低．甚至對正常胃腸功能狀態的敏感性增高，即異常性疼痛，與內臟相對應的軀體牽涉痛范圍擴大［5］。內臟感覺由初級傳入神經元產生，其神經末梢與腸神經系統的神經末梢相互混合。ICC是胃腸慢波的起搏細胞，ICC周圍常伴有腸神經纖維環繞，而且內臟初級感覺神經纖維還與ICC密切聯系，這為神經信號傳遞提供了解剖基礎。ICC的一個重要功能是接收腸神經系統神經元的信號傳遞，神經的傳導不是通過神經肌肉間松散的突觸結構而是通過神經末端和ICC之間的突觸樣連接。新近有研究證實環肌層和縱肌層內ICC還與肌內迷走神經的膨體之間是以突觸樣聯系傳遞信號的［6］。ICC是腸神經作用的首要靶細胞，擔當了接受與傳遞興奮和抑制性神經遞質的作用，ICC細胞膜上存在多種受體如毒蕈堿 M2、M3受體、神經激肽受體、VIP受體和5-HT受體，并可觀察到ICC對乙酰膽堿、NO、VIP、P物質等神經遞質均有反應性［7］。目前已證實腸神經系統及多種神經遞質在外周、脊髓及中樞參與內臟高敏感的調控。本實驗通過冰醋酸連續刺激新生期大鼠結腸致內臟高敏感動物模型。該模型不影響大鼠的生長發育，成年后大鼠結腸組織學無明顯炎性反應改變，適用于內臟高敏感性的研究。本研究發現ICC在內臟高敏感大鼠結腸中較對照組明顯增多，C-KIT蛋白表達在內臟高敏感大鼠結腸中較對照組明顯增強。由于ICC與腸神經系統、內臟初級感覺神經纖維有緊密的聯系，ICC細胞膜上存在VIP、5-HT等多種神經遞質受體，因此，推測ICC可能參與了內臟高敏感的形成，但其機制還有待進一步研究。

［1］余曉云，侯曉華．功能性胃腸病的發病機制［J］．醫學與哲學，2008，29:7 －9，30．

［2］Gibbons SJ，De Giorgio R，Pellegrini MSF，et al．Apoptotic cell death of human interstitial cells of Cajal［J］．Neurogastroenterol Motil，2009，2l:85 －93．

［3］劉雁冰，袁耀宗，陶然君，等．大鼠腸道高敏性模型的建立及其內臟敏感性評估［J］．中華消化雜志，2003，23:34－37．

［4］孫程程，王化虹，遲雁．直腸注射醋酸致內臟高敏感大鼠TNF-α mRNA表達的變化［J］．中國醫藥導刊，2008，10:127－129．

［5］Drossman DA．功能性胃腸病與羅馬Ⅲ的制定［M］//柯美云，方秀才．羅馬Ⅲ:功能性胃腸病．北京:科學出版社，2008:1－26．

［6］ Powley TL，Wang XY，Fox EA，et al．Ultrastructural evidence for communication between intramuscular vagal mechanoreceptors and interstitial cells of Caial in the rat fundus［J］．Neurogastroenterol Motif，2008，20:69 －79．

［7］Koh SD，Kin TW，Yan JV，et al．Regulation of pacemaker current in interstitial cells of Cajal from murine small intestine by cyclic nucleotides［J］．J Physiol，2000，277:127 －149．