結核菌快速檢測技術進展

徐荒朱紅

結核病發病率近年呈上升趨勢。據WHO統計，全世界目前約有20億人感染結核，每年新發病例890萬，死亡160萬［1］。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，疫情僅次印度居世界第2位，每年新發病人145萬人，死亡20余萬人，是其他傳染病死亡人數總和2倍［2］。不典型結核和耐藥菌增多。由于涂片鏡檢平均檢出率只有25% ～35%，2008年我國出入境人員痰涂片陽性率17．86%［3］，傳統培養方法需2～3個月，給結核病診斷、治療藥物選擇和防控帶來一定困難。結核病快速診斷方法研究成為世界重點關注課題。近年來快速診斷方法出現給不典型和耐藥結核診斷和治療提供了很大幫助。下面就結核菌及耐藥性快速檢測技術作簡單介紹。

一、結核桿菌培養

1．液體培養方法:結核桿菌在液體培養基中生長較快，方法、設備簡單。WHO鼓勵中低收入國家使用此方法。

分枝桿菌快速手工培養(分枝桿菌生長指示管，the mycobacteria grouth indicate tube，MGIT):原理是在米德爾布魯克(Middlebrook)7H9肉湯培養基試管底部嵌有熒光指示器，有氧存在時指示器熄滅，結核菌生長時消耗培養基中溶解氧，指示器發出橙色熒光。采用生長對照管和含抗結核藥管37℃同時培養，比較兩管熒光即可得到細菌生長和藥敏情況。無論對一線或二線藥敏測試都簡單、精確、有效［1］。針對利福平和異煙肼敏感性檢測精確性＞90%。7～14天得到結果。The BACTEC MGIT960自動培養系統(the BACTEC MGIT960 automated system):原理同MGIT，但培養和熒光信號讀取按事先設計程序由儀器自動控制［1］。薈萃分析此系統測定結果有較高精確性和預測值，用于二線藥敏實驗能與BACTEC TB－460放射測量法(radiometric method)媲美。檢測氧氟沙星此法敏感性和特異性均為100%。本系統優點同MGIT，但設備需要一定資金，樣品量受儀器最大工作負荷限制［4，5］。適合于高負擔低資源國家中小規模實驗室應用。

The BacT/Alert 3D系統(The BacT/Alert 3D system):采用改良7H9 Middlebrook肉湯培養基，試管底部裝有一比色傳感器，能感受細菌代謝產生的CO2，由綠色變成黃色，儀器自動持續監測顏色變化。該系統用于結核菌快速培養，藥敏檢測靈敏度和特異度都較好［1］。但對二線藥敏試驗報道不足。

The Versa TREK系統(The Versa TREK system):采用富含7H9 Middlebrook肉湯培養基，細菌代謝使培養容器內壓力變化，通過監測壓力變化了解細菌生長情況。培養和檢測過程在同一裝置內完成。有關其應用報道不多，實用性有待進一步評估［1］。

顯微鏡觀察肉湯－藥敏測試［the microscopic observation broth－drug susceptibility assay(MODS)］:結核桿菌生長過程中形成特征性“繩帶”(cord)。采用含或不含抗生素7H9液體培養基在24孔板中培養細菌，利用倒置顯微鏡，40倍鏡頭觀察結核菌特征性cord形成情況。薈萃分析MODS測試利福平和異煙肼敏感性，直接用于臨床涂陽痰標本敏感性96%和92%，特異性96%。平均21天100%得到結果，便宜，但安全性較差［4，6，7］。

比色氧化還原指示劑法(the colorimetric redox indicator methods):將氧化還原指示劑放入含或不含抗結核藥培養基中，細菌生長時培養基顏色發生改變，比較兩管培養物顏色能判斷結核菌是否耐藥。方法簡單、快捷，培養7～8天肉眼能觀察結果。薈萃分析表明耐藥性監測有較高敏感度和特異度［1］。氧化還原指示劑有多種，可根據不同藥物選擇相對敏感指示劑。

載玻片培養技術(slide－culture technique):在載玻片培養基礎上改進而來一種快速培養技術［1］。將10個樣品涂片到滅菌載玻片一端，將玻片縱切成兩半，放入裝有7ml液體培養基培養瓶里，3瓶不含抗結核藥作為對照，其他瓶含抗結核藥做藥敏試驗，置冰箱過夜，次日將培養瓶移入培養箱37℃，培養10天。載玻片取出之前85℃加熱30min熱固定干燥，作萋－尼(Ziehl－Neelsen)染色，顯微鏡100倍鏡頭觀察抗酸菌落。當對照組有最少一個菌落，藥敏組只要有菌落出現即耐藥。此法精確度利福平和異煙肼分別96%和90%，其他藥物略低。原理簡單，結果明確，但操作繁雜，安全性較差。

2．固體培養方法:(1)TK培養基(Medium)結核菌快速培養系統:生長中結核桿菌代謝活動使培養基顏色改變，在細菌菌落形成前根據培養基顏色鑒定是否分枝桿菌生長。方法簡單、經濟，比常規培養縮短10天出結果［1］。能排除常見細菌污染，鑒別結核與非結核分枝桿菌。規范應用條件和完善質量控制，將是一種實用、有前途的方法。(2)噬菌體法檢測結核桿菌:1)噬菌體生物擴增法快速檢測結核菌:1997年由Wilson等開發。基本原理是將特異性裂解分枝桿菌噬菌體引入含有結核分枝桿菌待測樣品中，噬菌體能感染活分枝桿菌，未進入菌體多余噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，已進入菌體內噬菌體不受影響。噬菌體在感染分枝桿菌內大量繁殖，并將菌體裂解，釋放出大量子代噬菌體，可感染隨后加入的指示細胞，并將其裂解，在瓊脂平板培養基上出現透明噬菌斑。根據噬菌斑有無和多少來判斷標本中有無活結核分枝桿菌感染或其他幾種為數不多的非結核分枝桿菌。FASTPlaqueTB(Biotec Laboratories Ltd，Ipswich，UK)就是基于這種原理設計的商業試劑盒，3天能得到結果。用于診斷敏感性略高于涂片染色，但不及傳統培養。噬菌體D29宿主比較寬泛，需要確認試驗排除其他分枝桿菌感染。FASTPlaqueTBRif(Biotec Laboratories Ltd)一種商業化測定利福平敏感性試劑盒。薈萃分析表明檢測對利福平敏感性商業化試劑敏感度81% ～100%，特異度73% ～100%。而實驗室內部試劑敏感度88% ～100%，特異度84% ～100%［8］。陽性預測值 92%，陰性預測值 95%，特異度為99.0%，靈敏度70．3%。快捷，2天獲得結果，無需昂貴設備。但存在少數假陽性。2)螢光素酶報告噬菌體(Luciferase reporter phages，LRP):將整合有螢光素酶基因的噬菌體感染結核分枝桿菌，螢光素酶基因得到表達，在菌內三磷酸腺苷(ATP)存在情況下，催化培養基中螢光素底物，細菌發出螢光。通過膠片感光或光度計檢測結果。螢光素酶報告噬菌體能精確檢測活分枝桿菌感染，7天得到結果，但敏感性不如鏡檢。另外需要在測試中加入p－硝基－a－乙酰氨基－b－羥基苯丙酮 (p－nitro－a－acetylamino－b－hydroxy propiophenone，NAP)做確認試驗排除非結核分枝桿菌感染造成假陽性結果。據報道整合了螢光素酶報告基因的Che12和TM4噬菌體可用于檢測活動期和休眠期結核桿菌［9］。用于藥敏檢測得到結果時間利福平為數小時，乙胺丁醇、異煙肼、環丙沙星為2～3天。LRP－NAP實驗證實LRP用于鑒定結核桿菌和84份臨床標本藥敏實驗，敏感性和特異性分別97%和100%。結果一致率達到98．65%。光度計檢測儀器昂貴，膠片感光便宜，適合高負擔設備條件不足的實驗室用。

3．硝酸鹽還原酶測定 (the nitrate reductase assay，NRA):結核桿菌能將硝酸鹽轉變成為亞硝酸鹽，產生顏色變化。是一種快速藥敏試驗方法。可直接用于痰標本檢測，價廉。測試利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇敏感度分別為94% ～100%、＞92%、100%、93%;特異度為94% ～100%、＞92%、100%、100% ，23 天 100% 得到結果［6，7，10～13］。

E實驗(the e－test):采用一種浸有不同濃度梯度抗結核藥塑料條放在接種有結核桿菌瓊脂培養基表面直接閱讀生長抑制區的一種快速藥敏實驗方法。目前除檢測利福平結果稍好外，其他藥物結果不理想［11］。可同時測試多種藥物。但易污染，假陽性和陰性率較高，重復實驗使費用增加，技術有待改進［14］。

二、核酸擴增技術(nucleic acid amplification test，NAA)

1．檢測臨床標本中結核桿菌:7種商業試劑盒:Amplicor MTB，Cobas Amplicor MTB，BDProbeTecET，E － MTD，LCx，Genotype Mycobacteria Direct Test，Gen－Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test(后兩種獲得美國FDA認證)平均敏感度和特異度分別為痰涂陽標本93% ～98%，71% ～96%;痰涂陰標本 57．0% ～79．3%，97% ～99%［15～17］。與標本菌含量、存放時間、處理過程、是否污染，是否存在擴增抑制劑、擴增方法、檢測方法有關。突出優點是快捷，但儀器和試劑較貴。目前一種恒溫多聚酶鏈反應(PCR)方法所需設備簡單，操作簡便，1～2h得到結果，如:交叉引物擴增，環介導等溫擴增靈敏度高于常規 PCR，肉眼觀察結果［18～19］。

2．鑒定分枝桿菌種類:傳統鑒定菌種依靠生化方法，繁瑣、費時、不精確。高壓液相(HPLC)法設備昂貴。Accuprobe試劑盒利用DNA探針，直接鑒定臨床標本。可以辨別復合結核桿菌組(M．tuberculosis complex)，鳥結核分枝桿菌(M．avium)，胞內分枝桿菌(M．intracellulare)，堪薩斯分枝桿菌(M．Kansasii)，戈登氏分枝桿菌(M．gordonae)5種分枝桿菌。酶切分析分枝桿菌PCR產物基因多態性位點或高變化區域可以鑒別30多種分枝桿菌。

3．檢測與耐藥有關結核菌基因突變:耐藥產生絕大多數與結核菌基因突變有關。鑒定突變基因能確定結核菌是否耐藥。市面上試劑盒測試利福平的效果高于其他抗結核藥。如Genotype MTBDR plus試劑盒測試利福平、異煙肼、多種藥物抵抗方法敏感度分別為99% ～100%、88% ～96%、86%;特異度94% ～99% 、100% 、100%［5，7］。薈萃分析商業探針敏感度為95%，特異度為100%［15］。單鏈構象多態性PCR對利福平抗藥菌檢測敏感度79%，特異度96%。

三、展 望

綜上所述，結核菌快速培養方法簡單，便宜，結果可靠。但仍需要10～20天獲得結果。核酸擴增幾小時或1～2天得到結果，敏感度和特異度較高，表現出強大的鑒別診斷能力。但儀器試劑價格較貴。實驗室可根據本身條件選擇不同的檢測方法。

結核分枝桿菌快速檢測技術出現對結核病診斷提供了很大的幫助。但各種技術仍然存在一定缺陷，需要進一步完善。分枝桿菌快速手工培養和The BACTEC MGIT960自動培養系統直接用于臨床痰標本的檢測還需要大量試驗評估效果。MODS用于二線抗結核藥敏感性檢測還需大量實驗證實其應用價值。另外此方法的安全性需要改進。噬菌體擴增技術用于利福平以外其他抗結核藥敏感性檢測還有待研究。載玻片培養、E實驗等其他快速培養技術和核酸擴增技術都存在需要進一步改進和完善的地方。改進完善已有的檢測技術和尋找快速、可靠、經濟的新檢測方法和技術是一個長期的研究目標，還有很多工作需要我們去做。

1 Palomino JC，Martin A，Groll AV，et al．Rapid culture－based methods for drug － resistance detection in mycobacterium tuberculosis［J］．J of Microbiol Methods，2008，75:161 －166

2 陳維廣．BiPAP呼吸機對COPD合并Ⅱ型呼吸衰竭的治療價值探討［J］．國際醫藥衛生導報，2008，14(3):17－19

3 王健，方筠，張琳，等．上海出入境人員結核病實驗室檢測情況分析［J］．中國國境檢疫雜志，2010，33(1):15－17

4 Devasia1 RA，Blackman A，May C，et al．Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis:an assessment of MGIT 960，MODS and nitrate reductase assay and fluoroquinolone cross － resistance［J］．J of Antimicrobial Chemother，2009，63，1173－1178

5 Bwanga F，Joloba ML，Haile M，et al．Evaluation of seven tests for the rapid detection of multidrug－resistant tuberculosis in Uganda［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2010，14(7):890－895

6 Bwanga F，Haile M，Joloba ML，et al．Direct nitrate reductase assay versus microscopic observation drug susceptibility test for rapid detection of MDR － TB in Uganda［J］．PLoSONE，2011，6(5):e19565

7 Bwanga F，Hoffner S，Haile M，et al．Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis:a meta － analysis［J］．BMC Infectious Diseases，2009，9:67 －82

8 Minion J，Pai M．Bacteriophage assays for rifampicin resistance detection in mycobacteriumtuberculosis:updated meta － analysis［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2010，14(8):941－951

9 Dusthackeera A，Kumara V，Subbianb S，et al．Construction and evaluation of luciferase reporter phages for the detection of active and non － replicating tubercle bacilli［J］．J Microbiol Methods，2008，73(1):18－25

10 Gupta A，Anupurba S．Direct drug susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis against primary anti－TB drugs in northern India［J］．J Infect Dev Ctries，2010，4(11):695 －703

11 Shikama ML，Ferro e Silva R，Villela G，et al．Multicenter study of nitrate reductase assay for rapid detection of rifampin－resistant M．tuberculosis［J］．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13(3):377 －380

12 Martin A，Panaiotov S，Portaels F，et al．The nitrate reductase assay for the rapid detection of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta － analysis［J］．J of Antimicrobial Chemother，2008，62:56 －64

13 Gupta A，Anupurba S．Direct drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against primary anti－TB drugs in northern India［J］．J Infect Dev Ctries，2010，4(11):695 －703

14 Verma JS，Rawat D，Hasan A，et al．The use of E－test for the drug susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis－a solution or an illusion?［J］．Indian J of Med Microbiol，2010，28(1):30 －33

15 Cho SN．Current issue on molecular and immunological diagnosis of tuberculosis［J］．Yousi Medical Journal，2007，48(3):347 － 359

16 Laraque F，Griggs A，Slopen M，et al．Performance of nucleic acid amplification tests for diagnosis of tuberculosis in a large Urban setting［J］．Clin Infect Dis，2009，49:46－54

17 Syre H，Myneedu VP，Arora VA，et al．Direct detection of mycobacterial species in pulmonary specimens by two rapid Amplification tests，the Gen－probe Amplified mycobacterium tuberculosis derect test and the Genotype mycobacteria direct test［J］．J Clin Microbiol，2009，47(11):3635－3639

18 Fang R，LI X，Hu L，et al．Cross－priming amplification for rapid detection of mycobacterium tuberculosis in sputum specimens［J］．J Clin Microbiol，2009，47(3):845 －847

19 Aryan E，Makvandi M，FarajzadehA，et al．A noval and more sensitive loop－mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of mycobacterium tuberculosis complex［J］．Microbiol Res，2010，165:211－220