腸道微生物與新生兒壞死性小腸結腸炎

帥向華

新生兒壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒消化系統極為嚴重的疾病，有較高的發病率和病死率。臨床上以腹脹、嘔吐、腹瀉、便血、嚴重者發生休克及多系統器官功能衰竭為主要臨床表現，腹部X線檢查以腸壁囊樣積氣為特征。有報道，NEC的發病率大概在2% ～5%之間［1］。隨著新生兒學的發展，極低出生體重兒(VLBW)存活率不斷提高，NEC的發病率還在上升。NEC的病死率在10% ～50%之間，重度NEC的病死率接近100%。存活的NEC患兒常有長期后遺癥，包括腸管狹窄、短腸綜合征、反復感染、體重不增和腦癱等［2］。由于NEC病死率高，長期后遺癥重，從根本明確該病的發病機制顯得非常迫切與重要。

一、腸道微生物參與NEC發病的臨床證據

目前NEC的病因及發病機制尚未完全明確，一般認為是多因素綜合作用所致，包括低胎齡、低出生體重、低Apgar評分、透明膜病、配方奶喂養、臍靜脈插管和腸道缺血等［3］，導致腸黏膜屏障功能不全或受損、細菌在腸腔內過度繁殖并產生大量炎性介質，最終導致腸壁損傷甚至壞死、穿孔和全身炎癥反應(SIRS)甚至休克、多器官衰竭。有數據顯示，預防性口服萬古霉素或慶大霉素可以減少NEC的發生率［4］。廣譜抗生素治療NEC及微生態制劑在臨床上應用取得的良好效果，提示控制腸道微生物可以影響NEC患兒的預后［5］。從晚期NEC患兒的血、腹腔積液和大便中能分離出腸道細菌，包括大腸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯桿菌屬等，偶有凝固酶陰性的葡萄球菌屬［6］。這些感染可能是由于細菌移位，即腸道原籍菌通過不成熟、受損的腸黏膜引起的。因此有學者推測，腸道微生物在NEC發病機制中起重要的作用。

二、腸道微生物參與NEC發病的作用機制

1．腸道微生物構成腸黏膜的部分屏障功能:腸黏膜具有阻止病原微生物和抗原進入體循環的屏障功能，包括外屏障功能和內屏障功能［7］。胃酸、腸蠕動、黏液層、分泌型免疫球蛋白A及正常腸道菌群等構成了腸黏膜的外屏障功能，它抑制了病原微生物在腸道內的定植和在腸上皮細胞上的黏附［8］。腸上皮細胞的半透膜和細胞間的緊密連接(TJs)等構成了腸黏膜的內屏障功能，又稱為細胞防御機制，它能阻止病原微生物通過和限制大分子物質的彌散［9］。保持腸黏膜屏障功能的完整，才能保護機體免受病原微生物的侵害。

新生兒出生后就有細菌在腸道內定植。新生兒和成人比較，腸道菌群有很大的不同。在新生兒，原籍菌在黏膜表面和腸腔內的定植有一種特殊的方式，即所謂的“連續過程(succession)”［10］。它可分為 4個期，第Ⅰ期，也就是最初獲得期，從出生至生后2周，在這一期，鏈球菌和大腸桿菌在腸道內占絕對優勢，革蘭陽性菌、無芽孢厭氧菌開始出現，包括母乳喂養的新生兒以雙歧桿菌占優勢，配方奶喂養的新生兒以乳桿菌占優勢，梭狀芽胞桿菌和類桿菌屬也能發現，但數量較少。第Ⅱ期發生于第Ⅰ期結束至開始消化固體食物之前，在這一期內，類桿菌屬數量逐漸增加。第Ⅲ期發生于開始添加輔食至徹底斷母乳之前，這一期一直持續到腸道菌群與成人相似(第Ⅳ期)。腸道原籍菌、特別是厭氧菌，抑制了大腸菌的數量，使他們處于相對低的水平。實際上，細菌定植是NEC發病的前提條件［11］。在第Ⅰ期由于厭氧菌相對缺乏，使得病原微生物非常容易在新生兒消化道內定植，從而促成了NEC的發病，所以在臨床上，NEC通常在生后2周左右發病。有研究顯示，共生菌不僅能調控某種保護基因的表達［12］，而且還能產生有毒物質對抗需氧菌、競爭占位效應、降低腸腔內pH值等，從而削弱病原微生物的黏附力，保護宿主。因此，正常的腸道菌群在整體上維持腸黏膜的屏障功能發揮了重要作用。

2．細菌在NEC發病中的分子學作用機制:病原微生物通過表面的病原體相關分子模式(PAMPs)與腸道的免疫系統發生相互作用。病原體相關分子模式是眾多微生物共有的一種保守的模式分子，它廣泛存在于病原體細胞表面，如脂多糖(LPS)、糖脂、鞭毛蛋白和核酸等。能識別PAMPs的受體稱為模式識別受體(pattern recognitionreceptor，PRRs)，它們與細菌PAMPs的相互作用，對保持腸壁完整性起關鍵作用。Toll－like受體(TLRs)是一個非常好的模式識別受體(PRRs)，至今已發現TLRs家族中的TLR1～10，其中，TLR－4已被廣泛研究，體內與體外的NEC動物試驗研究，都證實LPS通過TLR－4結合進行信號傳遞，促進細胞凋亡，導致 NEC癥狀的出現。Leaphart等［13］研究顯示 TLR－4增加了小鼠患 NEC的風險，從而證實了TLR－4信號的重要性。Caplan等［14］研究顯示母乳喂養動物的腸上皮細胞上的TLR－4表達短暫下降，試驗動物的NEC發病率明顯下降。在NEC小鼠試驗中，LPS濃度不僅在動物血漿中，而且在大便樣本中都有升高［15］。與這些研究結果一致，LPS濃度在NEC患兒血漿中也明顯升高。因此LPS通過與TLR－4結合進行信號傳遞是NEC發病機制中的重要分子學機制。

三、阪崎腸桿菌與NEC暴發

阪崎腸桿菌(enterobacter sakazakii，ES)是一種少見的微生物，它是革蘭染色陰性、無芽胞桿菌，以前被稱為黃色陰溝腸桿菌(yellow－pigmented Enterobacter cloacae)，1980年重新歸類為一種獨立的菌群。阪崎腸桿菌高度耐熱，并能耐受滲透壓和干燥，因此能在干燥的配方奶粉中存活。阪崎腸桿菌高度有毒，從0．36到66菌落形成單位/100克就足以引起疾病［16］。阪崎腸桿菌與新生兒膿毒癥和腦膜炎有關，也與NEC的暴發有關。Van Acker等［17］曾報道，在NICU中的12例NEC患兒，ES是NEC暴發的病因。其中2例由于ES感染而死亡，并證實這些病例直接與使用被ES污染的配方奶粉有關，因此作者推薦在NICU中使用滅菌的液體牛奶來防止由于ES引起的NEC暴發。另外一個ES暴發發生在美國的孟菲斯市，包括4個新生兒，其中3個有膿毒癥和NEC相關的血樣便腹瀉，4個病例中培養出具有相同質粒的ES，且追蹤到患兒曾使用同一罐奶粉［18］。這些報道均說明，細菌在NEC發病機制中發揮重要作用。絕大部分病原體通過有毒因子與特殊受體結合發揮對宿主的影響，如靶細胞表面的TLRs。通過NEC動物模型研究，細菌黏附腸上皮是ES入侵腸黏膜的第一步。Hunter等顯示ES與小腸上皮細胞(IEC－6細胞)結合，導致小鼠上皮細胞凋亡，并引起炎癥因子上調，如IL－6等，從而引起試驗小鼠的NEC臨床表現和形態學改變［19］。這種現象，在小鼠腸上皮細胞的體外試驗中得到同樣的結果。因此可以證實，異常的細菌定植改變腸上皮細胞炎癥信號，從而影響腸上皮修復及腸上皮細胞增殖，最終導致臨床NEC．。

四、微生態制劑在治療和預防NEC中的作用

根據世界衛生組織，微生態制劑是“活的微生物，當給予足夠的數量時，對宿主的健康有利”［20］。應用生態制劑主要是通過這些共生菌使嬰兒胃腸道菌群正常化。這些保護性的細菌屬包括雙歧桿菌和乳桿菌。最常用的生態制劑包括多種類型的雙歧桿菌屬(bifidobacterium)，比如短雙歧桿菌(B．breve)和乳雙歧桿菌(B．lactis)，乳桿菌屬(lactobacillus)，如嗜酸乳桿菌(L．acidophilus)和干酪乳桿菌(L．casei)，鏈球菌屬(streptococcus)，如唾液鏈球菌(S．salivaris)等［21］。

雙歧桿菌屬是最常用的微生態制劑，他們中的長雙歧桿菌(B．longum)和兩歧雙歧桿菌(B．bifidum)通常發現于嬰兒時期的腸內。也是母乳喂養的嬰兒腸腔內能檢測到的最普遍的微生物。多種類型的雙歧桿菌對人體有益，比如刺激腸道淋巴組織分泌保護性因子，并抵抗病原微生物的定植。有些種屬的雙歧桿菌如動物雙歧桿菌(B．animalis)和乳雙歧桿菌被應用于奶制品、食物添加劑和藥物制劑中。微生態制劑對腸黏膜的保護作用，其機制還沒有被完全闡明，研究表明，應用微生態制劑能保護早產兒腸道。一項有關微生態制劑在NEC中的應用的多中心回顧性研究，包括近1500個新生兒，結果顯示腸道內補充微生態制劑可以減少發生嚴重NEC的風險和早產兒的病死率。到目前為止，有4個關于在NICU患者中預防性使用微生態制劑的隨機對照研究。Hoyos等在1999年應用嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌(bifidobacterium infantis)于NICU患兒中可以減少NEC的發病率和NEC相關的病死率，而沒有不良反應。Bin－Nun等將嬰兒雙歧桿菌應用于145個VLBW新生兒，結果顯示研究組NEC的發病率和NEC相關的死亡病例低于對照組，然而，膿毒癥的發生率和抗生素的應用時間在研究組和對照組沒有區別。為了更好地闡明微生態制劑在NEC中發揮保護性作用的機制，許多的動物研究正在進行當中。曾有研究顯示，給暴露于組織缺氧、配方奶喂養的新生小鼠口服嬰兒雙歧桿菌，結果顯示對腸道炎癥反應有保護作用。最近的動物試驗研究顯示，預防性應用保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)可以抑制細胞因子的上調，減少ES導致的細胞凋亡，進一步推測，應用保加利亞乳桿菌可以保護被ES污染配方奶喂養的幼鼠發展成NEC，因此生態制劑可能成為一種減少新生兒發生NEC發病率的一種預防性治療方法。

總之，NES是多因素作用的結果，病因復雜，最終通過腸黏膜屏障功能受損、從而細菌繁殖、入侵，釋放大量炎性介質，導致NEC發病。人類胃腸道的微生態極其復雜，但隨著高通量(high－throughput)技術的進步，腸道微生物促成NEC的發病機制研究將會有新的發現。由于新生兒腸道內微生物缺乏多樣性，且容易控制，應用宏基因組(metagenomics)等高通量技術研究新生兒腸道微生態，對有NEC高風險的極低出生體重兒(VLBW)的存活和預后有重大意義。將來更多的治療方法和預防策略將從NEC的發病機制上進一步探索。

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